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        蜂蜜植物源毒性成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展

        2023-07-09 12:13:16劉珈伶
        食品安全導(dǎo)刊 2023年16期
        關(guān)鍵詞:植物檢測

        劉珈伶,韋 環(huán)

        (廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心,廣西南寧 530022)

        蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物混合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。蜂蜜除含有大量葡萄糖、果糖等糖類物質(zhì)外,還富含維生素、蛋白質(zhì)及有機(jī)酸等營養(yǎng)成分[1]。其具有抑菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3],是深受公眾喜愛的藥食同源食物。隨著人們對蜂產(chǎn)品需求量的不斷增加,蜂蜜質(zhì)量安全問題引發(fā)大眾關(guān)注,食用蜂蜜中毒惡性事件引發(fā)了民眾恐慌。蜂蜜本無毒,但在生產(chǎn)過程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜釀制的蜂蜜,可能會(huì)引起中毒[4-5]。我國廣西、云南和貴州等地均有食用有毒蜂蜜而引發(fā)食源性疾病的報(bào)道[6-7]。食用有毒蜂蜜后會(huì)引發(fā)如頭暈頭疼、嘔吐腹瀉、四肢麻木、呼吸中樞麻痹等中毒癥狀[5-7],甚至引發(fā)休克死亡,據(jù)統(tǒng)計(jì)野生蜂蜜引發(fā)中毒的死亡率在20%以上[8-9]。

        蜂蜜有毒物質(zhì)主要來源于蜜蜂采集有毒蜜源植物花粉?!妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》(GB 14963—2011)中規(guī)定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應(yīng)安全無毒,不得來源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物”。但標(biāo)準(zhǔn)未列出具體植物源毒性成分和相關(guān)檢測方法。國內(nèi)對有毒蜜源植物如雷公藤屬、博落回屬和鉤吻屬等毒性成分關(guān)注和研究較多[10-12]。但我國地大物博,除了上述有毒蜜源植物之外,還有毛茛科的烏頭屬、百合科的藜蘆屬和茄科的曼陀羅屬等多種毒性較高的毒源植物[5]。要預(yù)防和控制此類事件發(fā)生,快速準(zhǔn)確檢測出蜂蜜中植物源毒性成分十分重要。本文梳理了近年來報(bào)道的蜂蜜中主要的植物源毒性成分,對其前處理方法和檢測技術(shù)的特點(diǎn)和研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期為提高蜂蜜中植物源毒性成分監(jiān)測水平提供幫助,助推蜂產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

        1 蜂蜜中的植物源毒性成分及其分類

        含有天然毒素成分的植物種類繁多,毒性成分和中毒臨床表現(xiàn)各異。生物堿和萜類化合物是最常見的天然毒素。生物堿(Alkaloid)是存在于自然界中的一類堿性含氮有機(jī)化合物,結(jié)構(gòu)多變,數(shù)量龐大,目前已發(fā)現(xiàn)的天然生物堿化合物就有2 萬種以上[13]。分布最廣的為吡咯里西啶生物堿(Pyrrolizidine Alkaloids,PAs),目前已發(fā)現(xiàn)超過600 多個(gè)不同結(jié)構(gòu)的PAs 及其N-氧化物,存在于世界各地的6 000多種植物中,大部分PAs 對人體肝臟有毒[14]。萜類化合物(Terpenoids)是自然界中分布廣泛的天然產(chǎn)物之一,雙環(huán)倍半萜內(nèi)酯類、二萜皂苷類和松香烷型二萜等是蜂蜜植物源毒性成分的來源。植物源毒性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變,增加了研究難度。本文梳理了近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)蜂蜜植物源毒性化合物,并按結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類,如表1 所示。

        表1 蜂蜜中植物源毒性化合物名稱及分子式信息

        由表1 可見,已報(bào)道的毒性物質(zhì)中PAs 及其N-氧化物占近五成,其次是具有中樞神經(jīng)毒性的二萜類和吲哚類生物堿。這些毒性化合物毒性大,中毒癥狀急,致死率高,是研究的重點(diǎn)。對于數(shù)目龐大的PAs 要逐一制定安全限量并不科學(xué),歐盟2020 年新修訂的(EC)No. 1881/2006 以21 種PAs 總和正式設(shè)定了花粉等部分食品中PAs 的限量。盡管未涉及蜂蜜,但為開展蜂蜜中毒性物質(zhì)研究和制定合理限值提供了思路。

        2 蜂蜜中植物源毒性成分的前處理

        蜂蜜糖分高、黏度大、基質(zhì)干擾強(qiáng),樣品前處理技術(shù)成為準(zhǔn)確檢測毒性成分的關(guān)鍵。傳統(tǒng)前處理技術(shù)有溶劑提取法、液液萃取法等,普遍存在操作步驟煩瑣、有機(jī)溶劑消耗量大、凈化能力弱等缺點(diǎn)。隨著前處理技術(shù)的迅速發(fā)展,固相萃取、加速溶劑萃取、頂空固相微萃取等新興技術(shù)在蜂蜜植物源毒性成分檢測中獲得了良好的應(yīng)用。本文重點(diǎn)介紹應(yīng)用最為廣泛的固相萃取技術(shù),包括分散固相萃取法、磁性固相萃取法、離子交換固相萃取法等。

        2.1 分散固相萃取

        分散固相萃取技術(shù)也稱QuEChERS,簡便快捷,操作方便,應(yīng)用廣泛。PAs 的N-氧化物極性較大,為便于后期分析需要用鋅粉在凈化時(shí)還原成游離的PAs[19,29]。還原法提高了PAs 含量,增加了檢測靈敏度,同時(shí)減少了PAs N-氧化物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用,某些無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的N-氧化物也能被檢測到。在進(jìn)行廣譜篩查時(shí),常采用如NaCl+PSA 的簡易QuEChERS法,減少吸附劑復(fù)雜造成的損失[12]。QuEChERS 法可以根據(jù)凈化目標(biāo)物不同,選擇適宜的分散劑。例如,中性氧化鋁適合芳香胺類化合物的萃取,張?jiān)萚30]使用中性氧化鋁提取雷公藤甲素。石墨化炭黑(Graphitized Carbon Blacks,GCB)對于平面分子或者含有平面芳香環(huán)的分子具有強(qiáng)烈的吸附作用,ROMERA-TORRES 等[25]使 用GCB 提 取 蜂 蜜 中9 種莨菪烷類生物堿。QuEChERS 法靈活便捷,已在蜂蜜基質(zhì)中多種植物毒素的廣譜性提取凈化中得到廣泛開發(fā)和研究,專屬性依凈化目標(biāo)物的不同予以調(diào)整。

        2.2 磁性固相萃取

        磁性固相萃取是以功能化超順磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)為吸附材料,只需要一個(gè)外部磁場即可從各種溶液基質(zhì)中分離目標(biāo)物。該方法簡單快捷,易操作,專屬性強(qiáng),適用于分離復(fù)雜基質(zhì)中的痕量目標(biāo)物。段蘇然等[31]采用MNPs改良了QuEChERS 技術(shù)凈化,提取蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤甲素,減少了因PSA 吸附造成的損失和C18對雷公藤甲素電負(fù)性的影響。

        2.3 離子交換固相萃取

        離子交換固相萃取適用于帶電化合物,大部分生物堿帶正電荷,混合型陽離子交換固相萃?。∕CX)[4,22]和強(qiáng)陽離子交換固相萃?。⊿CX)[15,17,20]電負(fù)性強(qiáng),易發(fā)生陽離子交換。MCX 能提供反相吸附和陽離子交換雙重作用力,對堿性物質(zhì)保留能力更強(qiáng),在生物堿中應(yīng)用更廣。使用MCX 提取PAs 時(shí)常以稀酸-甲醇為溶劑[22],但馬桑亭類、鬧羊花類毒素等會(huì)因甲醇共流出而損失。為兼顧更多生物堿,韋環(huán)等[4]將溶劑換為水,在PAs、馬桑亭和鬧羊花等20 種不同類別植物毒素的凈化中得到較好應(yīng)用。

        3 蜂蜜中植物源毒性成分的檢測技術(shù)

        蜂蜜的植物源毒性成分種類多,毒源范圍廣,各種化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜,同分異構(gòu)體多,檢測難度大。其檢測方法主要包括基于視覺感官檢測的蜂蜜孢粉學(xué)[11,21-22]、色譜檢測技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)[18]等。蜂蜜孢粉學(xué)能提供蜜源信息,但無法對毒性物質(zhì)定

        性和定量。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)需要抗原與抗體有特異反應(yīng),目前還無法達(dá)到多有毒物質(zhì)同時(shí)檢測。色譜技術(shù)具有強(qiáng)大分離功能,操作方便,條件溫和,方法多樣,使得多毒素同時(shí)定性定量成為可能。薄層色譜法是簡單的色譜分析方法,操作簡便,早期也用于快速檢測植物毒素,但靈敏度不高,分離能力有限,對部分毒性物質(zhì)的專一性不夠,目前已被其他分離能力更高的技術(shù)所取代。

        3.1 高效液相色譜法

        高 效 液 相 色 譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物的重要分離分析技術(shù)。一般采用C18作為分離柱,甲醇/乙腈-水作為流動(dòng)相檢測蜂蜜中的植物毒素[11,21]。降低柱溫對分離有利,HUNGERFORD 等[15]使用5 ℃的低溫HPLC 實(shí)現(xiàn)昆士蘭蜂蜜中Indicine 和Lycopsamine 兩種PAs 的立體異構(gòu)體分離。HPLC 與二極管陣列檢測器(Photo-Diode Array,PDA)聯(lián)用時(shí),可得任意時(shí)間的光譜圖,相當(dāng)于與紫外聯(lián)用[21]。但HPLC 基質(zhì)干擾嚴(yán)重,靈敏度不足,因此逐步被色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所取代。

        3.2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

        氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的化合物,商業(yè)化的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索功能實(shí)現(xiàn)了未知/已知物的定性。GC-MS 對目標(biāo)物分子量和熱穩(wěn)定性要求高,部分毒性物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配度低,部分?jǐn)?shù)據(jù)庫中缺乏對應(yīng)信息的N-氧化物,定性困難。

        3.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

        超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)的質(zhì)譜一般是指低分辨率的四極桿(QQQ)和離子阱(Trap)質(zhì)譜。它對高沸點(diǎn)、不揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物在定性、定量分析方面具有特殊優(yōu)勢,是蜂蜜中毒性物質(zhì)檢測最通用和最有用的方法。大氣壓電離化學(xué)電離離子源(Atmospheric Pressure Chemical Ionization,APCI)不能生成一系列多電荷離子,一般用于弱極性、小分子有機(jī)物。如PAs 的N-氧化物極性強(qiáng),需要還原后使用APCI 源檢測蜂蜜中PAs 總量[20]。ESI 源是主要的離子源,多位學(xué)者建立了ESI 模式下,采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)測定PAs、雷公藤毒素、馬桑毒素的定量方法[19,27,31]。離子阱質(zhì)譜可得到多級(jí)質(zhì)譜離子碎片,用于推導(dǎo)未知化合物結(jié)構(gòu)。SIXTO 等[16]采用3 種離子檢測模式在沒有分析標(biāo)準(zhǔn)的情況下定性和定量蜂蜜中毒性最大的PAs。低分辨率質(zhì)譜雖然痕量分析準(zhǔn)確,但基質(zhì)干擾嚴(yán)重,不能有效區(qū)分目標(biāo)化合物和干擾化合物,存在假陽性。

        3.4 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法

        高分辨 質(zhì) 譜(High Resolution Mass Spectrum,HRMS)提供的精確質(zhì)量信息可以用來確定離子峰的元素組成,比低分辨質(zhì)譜儀定性結(jié)果更準(zhǔn)確,靈敏度更高,類型包括四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Triple Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer,Q-TOF MS)、 靜 電 軌 道 阱 質(zhì) 譜(Orbitrap Mass Spectrometer,Orbitrap MS)、傅立葉變換質(zhì)譜等。其中,傅立葉變換質(zhì)譜價(jià)格高昂難操作,應(yīng)用少。Q-TOF MS 和Orbitrap MS 分辨能力和價(jià)格同比略低,但質(zhì)量范圍寬、掃描速度快、維護(hù)簡單,是最常見、普及最廣的高分辨質(zhì)譜。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)可提供瞬時(shí)高精度全譜譜圖,信息量全。相較而言TOF MS 分辨率較低,質(zhì)量穩(wěn)定性較差,需與其他串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用才能實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜功能,用于鑒別未知分析物[23]。靜電軌道離子阱質(zhì)譜(Orbitrap MS)是一種基于靜電場電磁理論的新型高分辨質(zhì)量分析器,已經(jīng)在藥物、食品、環(huán)境等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。相比Q-TOF MS,該方法能提供更高的質(zhì)量精度和穩(wěn)定性,但采集速率較低,在高速掃描時(shí),分辨率會(huì)顯著下降。常用掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描(Full MS/ddMS2),即單個(gè)分析周期獲得精確質(zhì)量的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜。以已知毒物的精準(zhǔn)特征離子質(zhì)譜信息建立專屬數(shù)據(jù)庫,可實(shí)現(xiàn)無標(biāo)準(zhǔn)品的非靶向篩查[4,15,17]。Orbitrap MS 的Targeted-SIM 采集模式還有媲美四極桿質(zhì)譜的定量能力。甘源等[10]以此建立蜂蜜中5 種雷公藤毒素的高分辨質(zhì)譜定量分析方法。Orbitrap MS 強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫、高質(zhì)量的質(zhì)譜圖,可輕松實(shí)現(xiàn)定性和定量。

        4 結(jié)語

        蜂蜜中毒事件偶發(fā)性高、致死率高、危害性強(qiáng)。目前食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)僅列舉了幾種毒性較大的蜜源植物名稱,未明確主要毒性成分及其檢測方法。植物源毒性物質(zhì)來源廣、種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,使得植物源毒性成分檢測和研究面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并建立了上百種物質(zhì)的鑒定檢測方法,但自然界中有毒物質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些,新的毒性物質(zhì)亟待去發(fā)現(xiàn)和研究。QuEChERs、MCX、MNPs 等高效固相萃取技術(shù)在樣品預(yù)處理中發(fā)揮越來越大的作用。QuEChERS 適于大量樣品的批量前處理需求,可與多種固相萃取技術(shù)靈活結(jié)合,提高專屬性。MCX 對堿性和中性化合物有很好的選擇性,受到了廣泛的關(guān)注及應(yīng)用。UPLC-MS/MS 具有痕量的檢測靈敏度、準(zhǔn)確的定量分析能力,成為植物毒素檢測研究和標(biāo)準(zhǔn)制定的重要參考方法。具有強(qiáng)大定性能力和全譜完整信息的UPLC-HRMS 大受青睞。靜電軌道阱質(zhì)譜憑借其精確質(zhì)量的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜建立的蜂蜜中植物源毒性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫,當(dāng)蜂蜜中毒事件發(fā)生時(shí)能實(shí)現(xiàn)無標(biāo)準(zhǔn)品非靶向高通量篩查,已成為未知毒物定性檢測的利器。上述新方法、新技術(shù)的應(yīng)用亟待建立快速高效、易于操作并且適用范圍較廣的檢測方法,從而提高蜂蜜中植物源毒性分的監(jiān)管力度,為蜂蜜的安全管理提供技術(shù)支持。

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