張瑞婷

（北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，北京 101300）

氟喹諾酮類藥物為白色或淡黃色晶型粉末，屬于廣譜抗生素，常被用于預(yù)防和治療奶牛疾病[1]。獸藥的過量使用或不當(dāng)使用與公眾的健康息息相關(guān)，長(zhǎng)期、低水平的接觸方式不僅導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)產(chǎn)生各種慢性、蓄積性毒害，給消費(fèi)者帶來潛在危險(xiǎn)。因此，建立獸藥殘留的分析方法對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控是十分必要的[2]。目前，獸藥殘留量的檢測(cè)方法主要有金標(biāo)檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、氣相色譜法和質(zhì)譜法等[3]。超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)是選擇性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、分離效果好、靈敏度高和能自動(dòng)化操作[4]。其可以把待測(cè)組分分離與結(jié)構(gòu)的定量分析有機(jī)結(jié)合在一起，特別適用于藥物殘留量和藥物的確證分析[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters 公司）；氮吹濃縮儀（Organomatian Associates 公司）；冷凍離心機(jī)（Sigma 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，Waters 公司）。

8 種喹諾酮類獸藥標(biāo)品：恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星、氧氟沙星、奧比沙星、萘啶酸和噁喹酸，均購(gòu)于德國(guó)DR 公司；乙腈、甲醇、正己烷和甲酸（HPLC 級(jí)）；超純水（Mili-Q 公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

精密稱量各種藥品標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確到0.1 mg）于10 mL 容量瓶（棕色）中，用乙腈超聲溶解并定容至刻度（其中噁喹酸需加少量NaOH 溶液溶解），配制成1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 混標(biāo)工作溶液

取洗凈烘干的50 mL 棕色容量瓶，加入500 μL儲(chǔ)備液，乙腈定容至刻度，配制成濃度為10.0 μg·mL-1的混標(biāo)中間溶液，置于4 ℃冰箱冷藏避光保存。

1.2.3 流動(dòng)相

0.3 %甲酸水溶液：準(zhǔn)確吸取3 mL甲酸至1 000 mL容量瓶，用超純水定容至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用。流動(dòng)相：乙腈∶0.3%甲酸=10 ∶90。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

將牛奶樣品輕晃混勻后稱取5.00 g（精確到0.01 g），裝入50 mL 的PP 管中，依次加入無(wú)水硫酸鈉5 g，1%的甲酸-乙腈溶液20 mL，輕柔渦旋混勻，充分反應(yīng)。超聲波提取時(shí)，保持處于冰浴環(huán)境中，離心轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，時(shí)間5 min，之后取上清液于另一潔凈的離心管中。將剩余殘?jiān)貜?fù)一次上述操作，取上清液。吸取10 mL 提取到的上清液，加入20 mL 乙腈飽和的正己烷，振蕩?kù)o置分層棄去正己烷層，氮?dú)獯抵两伞?/p>

1.3.2 凈化

HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）使用前用6 mL甲醇洗滌、6 mL 水凈化，將提取的上清液以2 ～3 mL·min-1的速度過柱，過兩次后棄去濾液，用2 mL 5%的甲醇溶液淋洗，棄去淋洗液，減壓真空泵抽取5 min，在吸附柱中加入5 mL 甲醇洗脫液，5 000 r·min-1離心1 min，將收集到的洗脫液在氮?dú)庀麓抵两珊?，加? mL流動(dòng)相溶液溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，以備上機(jī)分析測(cè)定使用。

1.4 測(cè)定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm BEH 顆粒，美國(guó)沃特世公司）；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為0.3% 甲酸水溶液；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離-正離子模式（ESI+）；檢測(cè)方式：MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔氣流量：120 L·h-1；碰撞氣：氬氣；碰撞氣壓：0.18 Pa。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

在酸性提取溶劑中，氟喹諾酮類藥物更容易被萃取；乙腈屬于極性溶劑，可避免從樣品中提取過多的脂肪，同時(shí)具有很好的蛋白沉積效果，可沉積樣品中99%的蛋白，避免其他雜質(zhì)的干擾。因此，初步確定采用乙腈為提取溶劑。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)純乙腈、1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈3 種提取劑提取效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示酸化乙腈提取效果更佳。其中1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈的提取效果相差不大，但1%甲酸-乙腈提取后的色譜峰更加尖銳，故確定最終提取溶劑為1%甲酸-乙腈。

2.2 流動(dòng)相的選擇及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以不同比例的乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，為了提高正離子化效率并改善峰形，同時(shí)考慮到分析組分中大多含有氨基和羧基基團(tuán)，所以分別嘗試了在水相中加入0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨、10 mmol·L-1甲酸銨進(jìn)行洗脫。對(duì)比結(jié)果顯示，流動(dòng)相中加入0.3%甲酸時(shí)，樣品由結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)，靈敏度高，分離效果好。

質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化是通過ESI 探針分別將8 種獸藥（濃度1 mg·L-1）的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液在正電離模式下用質(zhì)譜蠕動(dòng)泵自動(dòng)進(jìn)樣，對(duì)每一種獸藥進(jìn)行母離子全掃描確定各種待測(cè)獸藥的分子離子，而后取其分子離子為母離子，對(duì)其進(jìn)行全掃描。選取豐度最強(qiáng)、干擾最小的兩個(gè)離子用于目標(biāo)分子的定量和定性分析，表1 為8 種獸藥質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)。

表1 8 種獸藥質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)

2.3 線性范圍及檢出限

將8 種待測(cè)獸藥配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。分別得到待測(cè)獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、定量限及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明在0.5 ～500.0 μg·mL-1，R2＞0.996，8 種獸藥的回歸方程均線性良好。通過逐級(jí)稀釋，根據(jù)信噪比（S/N）等于10 確定為定量下限，結(jié)果見表2。

表2 8 種獸藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.4 回收率與精密度

在待測(cè)樣品中添加8 種獸藥的混標(biāo)工作溶液，分別在10 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-13 個(gè)濃度水平下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每個(gè)濃度水平下進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算精密度。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，該方法的平均回收率為81.3%～98.8%，RSD 為2.3%～9.8%，表明本方法的回收率和RSD 均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，符合多殘留分析的要求。

表3 牛奶中8 種獸藥的回收率與精密度

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買15 份不同批次牛奶樣品，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1 份陽(yáng)性樣品。恩諾沙星檢出值12.1 μg·kg-1，其他藥物無(wú)檢出。該例陽(yáng)性樣品獸藥殘留量未超過GB 31650—2019 規(guī)定的最高殘留限量，可認(rèn)為是合格樣品。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的8 種獸藥殘留分析方法，通過對(duì)凈化方法、流動(dòng)相、質(zhì)譜條件等一系列實(shí)驗(yàn)條件的探索優(yōu)化，建立了UPLCMS/MS 同時(shí)檢測(cè)牛奶中8 種氟喹諾酮類獸藥的分析方法。該方法克服了檢測(cè)種類少、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)成本高等問題，適用于牛奶樣品多殘留的快速篩查和檢測(cè)。