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        腹瀉病例中5 種致瀉性大腸埃希菌的分子分型研究

        2023-07-09 12:13:10王雪梅
        食品安全導(dǎo)刊 2023年16期

        王雪梅,張 苗

        (淄博市疾病預(yù)防控制中心,山東淄博 255206)

        大腸埃希氏菌是人體的正常菌群,后來人們發(fā)現(xiàn)某些大腸埃希菌可引起腹瀉并在人群中流行,稱為致瀉大腸埃希菌(DiarrheagenicEscherichia coli,DEC)。20 世紀(jì)90 年代,DEC 被列為食品中致病菌之首[1]。根據(jù)攜帶毒力基因的不同,分為腸集聚黏附性大腸埃希菌(EnteroadherentEscherichia coli,EAEC)、腸道致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)、 腸 道侵襲性大腸埃希菌(EnterinvasiveEscherichia coli,EIEC)和腸出血性大腸埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC)[2]。脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分子分型主要用于病原體的溯源研究,其原理是用瓊脂塊將細(xì)菌包埋,選取適合的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,使酶切片段在電泳中通過變換電場方向而得到良好的分離。本研究通過對腹瀉人群分離的DEC 進(jìn)行PFGE 分子分型,旨在了解腹瀉患者DEC 感染的菌株間基因型聯(lián)系和差異,為DEC 的防控及分子分型的數(shù)據(jù)庫提供參考數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        菌株為腹瀉病例糞便中分離的DEC 92 株。PCR、PFGE 分別以5 種致瀉大腸標(biāo)準(zhǔn)菌株和布倫登盧普沙門菌H9812 作為質(zhì)控菌株。

        麥康凱平板(北京路橋);營養(yǎng)瓊脂(北京路橋);血瓊脂平板(北京路橋);核酸提取試劑盒(蘇州天隆);致瀉性大腸埃希菌多重PCR 檢測試劑盒(卓誠惠生);全自動毛細(xì)管電泳試劑盒(卓誠惠生);XbaI(TaKaRa 生物公司)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        核 酸提 取 儀(NP968,蘇 州 天 隆);PCR 儀(Mastercycler gradient,eppendorf 公司);多重食源性致病菌核酸檢測系統(tǒng)(PathoMPSTM,凱杰公司);恒溫振蕩水浴搖床(DSHZ-300A,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);脈沖場電泳儀(CHEF Mapper XA,Bio-Rad 公司);凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+,Bio-Rad 公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        (1)將可疑DEC 劃線麥康凱平板進(jìn)行分離培養(yǎng),挑取可疑菌落,劃線營養(yǎng)瓊脂后進(jìn)行PCR 毒力基因檢測,根據(jù)所攜帶的毒力基因進(jìn)行型別鑒定。

        (2)將菌落劃線血瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)14~18 h。將細(xì)菌均勻懸浮于配制好的CSB 中制成4.0 ~4.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?,加?0 mg·mL-1蛋白酶K 后加1%瓊脂糖,待其凝固制成小膠塊,水浴搖床150 r·min-1左右溫育2 h。用無菌超純水洗2 次,再用TE 緩沖液洗滌4 次。

        (3)用內(nèi)切酶XbaI Ⅰ對切成2 mm 的小膠塊進(jìn)行酶切,酶切時間至少2 h。將酶切后的膠塊置于梳子上,倒入1%瓊脂糖,冷卻后放入電泳儀電泳19 h。

        (4)將電泳后的膠塊取出用GelRed 染液染色,純水清洗后,凝膠成像儀獲取圖像,用 BioNumerics軟件進(jìn)行分析處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 患者發(fā)病年齡分布

        0 ~12 歲患者檢出15 例,占16.30%;13 ~44歲患者檢出60 例,占65.22%;45 ~59 歲患者檢出9 例,占9.78%;≥60 歲患者檢出8 例,占8.70%,見表1。

        表1 患者發(fā)病年齡分布

        2.2 PFGE 分子分型

        對92 株攜帶毒力基因的DEC 進(jìn)行PFGE 分子分型,相似度最高為100%,最低的只有9.36%,主要結(jié)果見圖1。

        圖1 部分DEC 分子分型結(jié)果

        3 討論?

        據(jù)WHO 統(tǒng)計,全球每年約有20 億感染性腹瀉患者。感染性腹瀉已成為全球性重要公共衛(wèi)生問題,僅在2000 年腹瀉引起的死亡報告數(shù)就達(dá)到210 萬例[3]。DEC 是引起腹瀉的主要病原菌之一,從腹瀉患者中分離的比例呈上升趨勢。有研究顯示,DEC感染在細(xì)菌性感染腹瀉中居首位[4]。

        通過對DEC 患者進(jìn)行年齡段分析,結(jié)果表明,13 ~44 歲患者DEC 的檢出率較高,可能與該年齡段外出就餐頻繁,同時對食品衛(wèi)生重視程度不高有關(guān),因此在加強(qiáng)食品監(jiān)管的同時也要做好食品衛(wèi)生安全的健康教育。本文研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)中的結(jié)果基本相符[5],與河南省5 歲以下兒童為高發(fā)人群的結(jié)果不符[6]。

        目前常用的分子分型技術(shù)主要有mPCR 技術(shù)、重復(fù)序列PCR 技術(shù)、PFGE 技術(shù)。mPCR 是在同一個反應(yīng)體系中加入一對以上引物,分別擴(kuò)增不同的模板,得到不同的目的片段[7]。重復(fù)序列PCR 技術(shù)是一種細(xì)菌基因組指紋分析方法,是擴(kuò)增細(xì)菌基因組中的短重復(fù)序列,主要通過比較電泳條帶,分析基因組間的差異[8]。PFGE 是PulseNet China 重要的病原菌分型技術(shù),可實(shí)現(xiàn)全球監(jiān)測結(jié)果的比對[9]。PFGE 是細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,通過比較菌株之間PFGE 圖譜條帶分析菌株間同源性和相關(guān)性[10]。TALON 等[11]提出細(xì)菌條帶相似度在85%以上為同源克隆菌株。運(yùn)用PFGE 技術(shù)對腹瀉病例中檢出的DEC 菌株進(jìn)行同源性分析,并對相關(guān)病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,判斷是否發(fā)生流行,可提高疾病預(yù)警能力[12]。

        本研究選取腹瀉病人糞便中分離的大腸埃希氏菌,通過毛細(xì)管電泳儀檢測其毒力基因,共檢出DEC 92 株, 其 中EAEC 60 株、ETEC 20 株、EPEC 10 株,EHEC、EIEC 各1 株。此次檢測發(fā)現(xiàn),4 株ETEC 細(xì)菌條帶的相似度為100%。其中3 株來自2017 年在同一醫(yī)院就診的3 名病例,1 株來自2016年在此醫(yī)院就診的病例。在不同時間不同患者中檢出同一帶型的ETEC,有報道稱可能會存在部分菌株因其遺傳特性比較穩(wěn)定,在環(huán)境中長期存在[13]。另外,2 株來自同一病例攜帶不同毒力基因組合的EAEC,DNA 條帶相似度為100%。檢測的大多數(shù)菌株的條帶相似度低于85%,說明由DEC 引起患者腹瀉的菌株,其基因型存在多態(tài)性,以散發(fā)病例為主。

        綜上所述,通過對腹瀉病例中分離的DEC 進(jìn)行PFGE 分子分型,為DEC 病例的監(jiān)測和控制提供參考數(shù)據(jù),為深入研究DEC 分子多樣性提供基礎(chǔ),為DEC 導(dǎo)致腹瀉的分子流行病學(xué)研究提供依據(jù),對暴發(fā)預(yù)警及溯源調(diào)查具有重要意義。

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