鄭雪雪，謝春江，張 輝，黃 鵬，次仁拉姆，格桑央宗

（1.合肥市計(jì)量測(cè)試研究院，安徽合肥 230088；2.山南市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，西藏山南 856000）

醬油，俗稱豉油，一般由大豆、小麥、食鹽等原料經(jīng)制油、發(fā)酵等工序制作而成。醬油中成分較多，包括食用鹽、氨基酸、糖類、有機(jī)酸類和各種色素等，以咸味為主，伴有鮮、香等味道，為常見的調(diào)味品，能提升菜肴味道，改變菜肴色澤[1-5]。

色氨酸為人體必需氨基酸，為醬油產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要指標(biāo)。色氨酸通過螯合反應(yīng)與食品中微量金屬離子有機(jī)結(jié)合，得到具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物活性較高的有機(jī)螯合物[6]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于色氨酸含量的測(cè)定方法主要有氨基酸分析儀法、衍生色譜法、凱氏定氮法等[7-14]。氨基酸自動(dòng)分析儀存在價(jià)格較貴、分析時(shí)間過長(zhǎng)等不足，且單一波長(zhǎng)掃描，定性的準(zhǔn)確性存在問題；衍生色譜法需合適的衍生劑與樣品反應(yīng)，分析效率較低，且衍生劑一般價(jià)格較高。凱氏定氮法則是通過間接測(cè)定氨基酸中氮含量來折算氨基酸含量，分析過程較復(fù)雜，分析結(jié)果準(zhǔn)確性不高。在檢測(cè)色氨酸含量時(shí)，為提高分析檢測(cè)靈敏度，現(xiàn)有的高效液相色譜法通常將色氨酸衍生后進(jìn)行色譜分析，色氨酸的衍生步驟復(fù)雜，衍生試劑昂貴。因此，本研究開發(fā)出一種操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高和結(jié)果可靠的檢測(cè)方法，可用于醬油中色氨酸含量的測(cè)定，為保障市場(chǎng)醬油品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma 公司）；氫氧化鈉（分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器Photo-Diode Array，PDA），日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液、試劑的配制

①1 000 μg·mL-1L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于10 mL 容量瓶中，用水溶解，定容，搖勻，4 ℃下避光保存。②L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別準(zhǔn)確移取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL 和1.0 mL 到10 mL 容量瓶中，純水溶解，定容，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度分別為10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1，4 ℃保存。③0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液。稱取0.4 g 氫氧化鈉，溶解于100 mL水中。④Na+濃度0.01 mol·L-1，pH=4.5 的乙酸鈉緩沖溶液。稱取0.82 g 無(wú)水乙酸鈉，溶解于1 000 mL水中，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.5。流動(dòng)相為乙酸鈉緩沖溶液∶甲醇=90 ∶10（V∶V）。

1.3.2 樣品前處理

稱取0.2 g醬油樣品于蛋白質(zhì)水解管中，加1.0 mL氫氧化鈉溶液，振搖混勻，充氮?dú)? min，密封，放入（110±2）℃的烘箱水解22 h，取出水解管，冷卻至室溫，用乙酸鈉緩沖溶液將水解液定量轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用乙酸鈉緩沖溶液定容，過膜，上機(jī)分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；最大吸收波長(zhǎng)：278 nm；流動(dòng)相：乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.5），甲醇；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相為乙酸鈉緩沖液-甲醇，比較甲醇比例為5%、8%、10%、15%和20%（V/V）的5 種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇比例超過10%會(huì)出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，且色氨酸出峰處干擾較大，流動(dòng)相中甲醇含量偏低則會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間過長(zhǎng)。綜合考慮，選擇甲醇比例為10%（V/V）的流動(dòng)相。

比 較 不 同 濃 度（0 mol·L-1、0.001 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1和0.020 mol·L-1）的乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）對(duì)色氨酸出峰效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)乙酸鈉濃度達(dá)到0.01 mol·L-1時(shí)，色氨酸的分離效果佳，峰形較好。隨著乙酸鈉濃度的降低，色氨酸出峰處有雜質(zhì)峰干擾，峰形較差，最終采用0.01 mol·L-1的乙酸鈉緩沖鹽體系作為流動(dòng)相中的水相。

2.2 流動(dòng)相pH 值的選擇

pH 值對(duì)出峰狀況及靈敏度存在一定影響，實(shí)驗(yàn)比較了不同pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5）的乙酸鈉-乙酸緩沖體系對(duì)色氨酸色譜峰分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相pH 值的降低，色氨酸出峰時(shí)間后移，導(dǎo)致分析時(shí)間過長(zhǎng)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，色氨酸達(dá)到分離要求，峰形相對(duì)較好。隨著pH 值的降低，分離效果更好，但加入流動(dòng)相中的乙酸含量大幅增加，長(zhǎng)期使用會(huì)大大縮短色譜柱的使用壽命。當(dāng)pH 值降至4.5 以下時(shí)，樣品中雜峰對(duì)色氨酸的檢測(cè)產(chǎn)生一定干擾。因此，將乙酸鈉-乙酸緩沖體系的pH 值定為4.5。

2.3 柱溫對(duì)色譜分離的影響

隨著色譜柱柱溫的升高，出峰時(shí)間將會(huì)縮短，30 ～40 ℃考察柱溫對(duì)色譜分離的影響。當(dāng)柱溫低于35 ℃時(shí)，對(duì)色氨酸的檢測(cè)有干擾；柱溫高于35 ℃時(shí)，出峰越來越快，分離效果逐漸下降，容易被雜質(zhì)峰干擾。綜合考慮，最終設(shè)定35 ℃作為該實(shí)驗(yàn)柱溫。

2.4 水解條件的選擇

色氨酸在酸水解條件下結(jié)構(gòu)容易被破壞，一般選擇堿水解方式。以空白樣品為基質(zhì)，添加相同質(zhì)量的大豆蛋白質(zhì)，1.0 mL（0.01 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1和0.50 mol·L-1）的氫氧化鈉溶液110 ℃水解22 h，比較目標(biāo)物的峰面積。圖1表明，色氨酸的峰面積隨水解濃度的增加而增大，氫氧化鈉溶液濃度為0.10 mol·L-1時(shí)，色氨酸的峰面積趨于平穩(wěn)，表明大豆蛋白質(zhì)中酰胺鍵完全斷裂，完全水解。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.10 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解蛋白質(zhì)。

圖1 水解濃度條件的影響

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)譜圖和曲線線性關(guān)系

在設(shè)定色譜條件下，采用HPLC-PAD 分析，色氨酸峰形良好，如圖2。選擇280 nm 為色氨酸的最大吸收峰，該波長(zhǎng)下靈敏度高，干擾小。在色氨酸濃度為10 ～100 μg·mL-1下，以峰面積為Y軸，色氨酸濃度為X軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=35 182.4X，具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

圖2 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

選取合適濃度的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，觀察噪音強(qiáng)度，計(jì)算出3 倍信噪比（S/N），將其作為檢出限，稀釋L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在儀器上響應(yīng)強(qiáng)度為3 倍噪音值，得到L-色氨酸檢出限為0.003 g·kg-1。稀釋L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其響應(yīng)強(qiáng)度為10 倍噪音值，將10 倍信噪比（S/N）作為定量限，得到L-色氨酸的定量限為0.01 g·kg-1，試驗(yàn)結(jié)果表明所建方法靈敏度較高。

2.5.2 加標(biāo)回收率及精密度

稱取18 份空白醬油樣品，分別加入低、中、高（定量限、2 倍定量限、10 倍定量限）濃度的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)1.3.2 處理，外標(biāo)法定量并計(jì)算加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性好，回收率較高，適用于醬油中色氨酸的測(cè)定。色氨酸精密度小于10%，可以滿足檢測(cè)要求。

表1 色氨酸在不同濃度條件下的加標(biāo)回收率（n=6）

2.5.3 樣品檢測(cè)

隨機(jī)網(wǎng)購(gòu)10 份醬油，按照本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，結(jié)果顯示8 份醬油中檢出色氨酸，檢出率80%，但含量存在一定差別。在醬油生產(chǎn)過程中，色氨酸結(jié)構(gòu)可能遭到了破壞，故有產(chǎn)品未檢出色氨酸。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了堿水解條件，選用乙酸鈉-乙酸緩沖體系作為水相流動(dòng)相，甲醇作為有機(jī)相流動(dòng)相，提高了檢測(cè)效率，增強(qiáng)了色氨酸的檢測(cè)靈敏度。通過優(yōu)化水相流動(dòng)相的pH 值以及柱溫，改善了色氨酸的分離效果。本研究建立的方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于醬油中色氨酸的檢測(cè)。