李琬婧，覃弘毅

（南寧市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧 530007）

2021 年柑橘產(chǎn)季全球柑橘產(chǎn)量達(dá)到1.585 億t，我國柑橘產(chǎn)量居世界首位，達(dá)4 460 萬t，占全球總產(chǎn)量的28%；出口量91.8 萬t 僅排名第5，表明我國柑橘主要用于國內(nèi)消費(fèi)[1]。沃柑是盛產(chǎn)于廣西武鳴的優(yōu)秀柑橘品種，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。2021 年有媒體報(bào)道部分沃柑果商未按規(guī)定使用農(nóng)藥，浸泡后的沃柑未經(jīng)存儲(chǔ)安全間隔期，直接送往市場銷售，引發(fā)消費(fèi)者對(duì)沃柑中農(nóng)藥殘留的擔(dān)憂[2]。因此有必要加強(qiáng)對(duì)沃柑中的常用農(nóng)藥2,4-二氯苯氧乙酸的檢測。2,4-二氯苯氧乙酸，別名2,4-滴，CAS 號(hào)94-75-7，是世界上使用最廣泛的除草劑品種之一，可作為殺菌保鮮劑，用于柑橘的防腐保鮮；此外，作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，2,4-滴在果實(shí)膨大期或采收前期使用可膨大果實(shí)，防治采前裂果、落果，延長貯存期[3]。

目前測定食用農(nóng)產(chǎn)品中2,4-滴的方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法前處理簡便，具有高靈敏度與高特異性，但儀器較為昂貴，儀器普及程度較低；液相色譜法無需進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)，但檢測靈敏度較低；氣相色譜法雖然需要對(duì)2,4-滴進(jìn)行衍生化，但檢測靈敏度高，儀器普及度高，在實(shí)際檢測中應(yīng)用廣泛。綜上所述，本試驗(yàn)選擇氣相色譜法對(duì)2,4-滴進(jìn)行測定。

我國的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中規(guī)定，2,4- 滴和2,4-滴鈉鹽在柑中的限量均為0.1 mg·kg-1。在規(guī)定了2,4-滴限量的品種中，除了個(gè)別品種使用《蔬菜中2,4-D 等13 種除草劑多殘留的測定 液相色譜質(zhì)譜法》（NY/T 1434—2007）測定，絕大部分品種的測定方法均指定為《糧食和蔬菜中2,4-滴殘留量的測定》（GB/T 5009.175—2003）[4]。由于GB/T 5009.175—2003為2003 年生效的標(biāo)準(zhǔn)[5]，發(fā)布至今已有20 年，標(biāo)準(zhǔn)較為老舊，其操作較為煩瑣，因此需要對(duì)氣相色譜法進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑試樣8 份（購自不同農(nóng)貿(mào)市場）；2,4-滴溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度為1 000 μg·mL-1，北京壇墨質(zhì)檢公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；正己烷、丙酮（農(nóng)殘級(jí)，德國默克公司）；正丁醇、濃硫酸（分析純，國藥試劑公司）；萃取鹽包（4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉，天津博納艾杰爾公司）；15 mL 凈化管（900 mg MgSO4、150 mg PSA，天津博納艾杰爾公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津光復(fù)公司）；氯化鈉（分析純，國藥試劑公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 Plus 氣相色譜儀（配ECD 檢測器，日本島津公司）；2-16KL 冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；JJ500 電子天平（精度0.01 g，常熟雙杰公司）；MS 3 digital 渦旋振蕩器（德國愛卡公司）；TurboVap氮吹濃縮儀（瑞典Biotage 公司）；瓶口分液器（德國普蘭德公司）；100 μL、1 000 μL、10 000 μL 移液槍（德國普蘭德公司）；SA320 振蕩器（日本雅馬拓公司）；0.22 μm 有機(jī)濾膜（上海安譜公司）；1 g/6 mL弗羅里夕固相萃取柱（天津博納艾杰爾公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試樣處理

（1）提取。稱取粉碎混勻的沃柑試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈，振蕩提取5 min，加入萃取鹽包，加入兩顆陶瓷均質(zhì)子，加蓋迅速搖勻，振蕩混勻5 min，以6 000 r·min-1離心5 min。精密移取上清液10 mL 于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干。

（2）衍生化。向上述離心管中加入200 μL 的正丁醇-濃硫酸（4+1）溶液，于室溫下反應(yīng)1 h。加入3 mL正己烷，渦旋1 min 后以6 000 r·min-1離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL 離心管中，下層用3 mL正己烷重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，50 ℃氮吹濃縮至約1 mL，待凈化。

（3）凈化。在弗羅里夕固相萃取柱中加入約1 cm厚的無水硫酸鈉，先用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，接著加入上述待凈化液，用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）洗脫，收集全部洗脫液于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹濃縮近干，加入1 mL 正己烷復(fù)溶，渦旋1 min，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，裝瓶待上機(jī)測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取1 mL 濃度為1 000 μg·mL-1的2,4-滴溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋并定容，得濃度為100 μg·mL-1的2,4-滴溶液。準(zhǔn)確吸取1 mL 濃度為100 μg·mL-1的2,4-滴溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋并定容，得濃度為10 μg·mL-1的2,4-滴溶液。分別準(zhǔn)確吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 和0.50 mL 的2,4- 滴溶液（濃度10 μg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋并定容。準(zhǔn)確吸取1 mL 各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干，后按樣品的衍生化步驟對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)行衍生化，氮吹近干后，加入1 mL 正己烷復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中進(jìn)行測定。

1.3.3 氣相色譜條件

色 譜 柱：DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm， 美國安捷倫公司）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；不分流進(jìn)樣；載氣：高純氮；載氣流速：1 mL·min-1；程序升溫：起始溫度為80 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，以30 ℃·min-1的速率升溫至260 ℃保持10 min；檢測器溫度：300 ℃；尾吹氣：60 mL·min-1；載氣：1 mL·min-1；采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法優(yōu)化

提取溶劑不僅要能高效地提取目標(biāo)化合物，同時(shí)要盡可能少地提取出其他雜質(zhì)，避免干擾，且不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全健康造成較大傷害。目前提取2,4-滴的溶劑主要有乙醚[5]、丙酮[6]、二氯甲烷[7]、乙腈[8]、乙酸乙酯[9]、氫氧化鈉溶液[10]及丙酮+正己烷[11]等。其中乙醚、二氯甲烷毒性較大，不利于實(shí)驗(yàn)人員的健康；乙酸乙酯提取使用量大，不僅浪費(fèi)試劑，后續(xù)操作無論是旋蒸濃縮還是直接過柱都要耗費(fèi)大量時(shí)間；氫氧化鈉溶液則不利于后續(xù)衍生化操作；丙酮、丙酮+正己烷的提取操作較為煩瑣。有研究考察了純乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈3 種提取溶劑的提取情況，回收率都在滿意范圍；且由于柑橘本身的低pH 值屬性，加酸對(duì)萃取溶液的pH 值改變不大[8]。綜上所述，本試驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑。

QuEChERS 是常用的農(nóng)藥獸藥殘留前處理方式，我國近年來也發(fā)布了較多采用QuEChERS 作為前處理方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，如GB 23200.113—2018、GB 23200.121—2021 等。本試驗(yàn)考察了萃取鹽包、萃取鹽包+凈化管、NaCl（5 g）3 種鹽析分層凈化的方式，其中萃取鹽包與NaCl 的回收率優(yōu)秀，而萃取鹽包+凈化管的回收率較差，無法滿足準(zhǔn)確度要求。同時(shí)，有文獻(xiàn)表明PSA 對(duì)2,4-滴有強(qiáng)烈的吸附[8]。使用NaCl 在單個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)可以接受，但在批量實(shí)驗(yàn)時(shí)，稱量NaCl 花費(fèi)的時(shí)間較多，極大地影響工作效率；而萃取鹽包均有成品售賣，可以直接購買使用。因此本試驗(yàn)從提高工作效率的角度出發(fā)，不考慮NaCl作為鹽析試劑。為了避免PSA 對(duì)2,4-滴的吸附，本試驗(yàn)僅使用萃取鹽包對(duì)提取液進(jìn)行鹽析分層，且后續(xù)有固相萃取作為凈化步驟，因此省略凈化管的操作對(duì)凈化效果影響不大。

2.2 衍生化方法優(yōu)化

查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與研究文獻(xiàn)可知，常見的衍生化試劑有14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）[5]、三氟化硼甲醇溶液（5 mL）[11]、正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）[6]。另有研究考察了無水乙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇、異戊醇作為衍生化試劑的效果，其中異戊醇衍生化結(jié)果的靈敏度最好，正丁醇其次[12]。綜合考慮，本試驗(yàn)對(duì)比了14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）與正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）的衍生化效果，結(jié)果表明這兩種衍生化試劑的衍生效率沒有明顯差異。但三氟化硼丁醇溶液價(jià)格比較昂貴，每次衍生化用量很大，試驗(yàn)成本較高；相比之下正丁醇與濃硫酸均為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)試劑，價(jià)格低廉，每次用量僅為三氟化硼丁醇溶液的1/25。因此本試驗(yàn)選擇正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）作為衍生化試劑，降低成本的同時(shí)兼顧了衍生效率。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍與檢出限、定量限

根據(jù)1.3.2 配制了0.010 mg·L-1、0.020 mg·L-1、0.050 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和0.500 mg·L-1的2,4-滴標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測定結(jié)果表明，2,4-滴在0.010 ～0.500 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，回歸方程為y=1 042.11x+9 998.80。根據(jù)GB 2763—2021 對(duì)沃柑中2,4-滴的限量要求，采用添加法確定檢出限和定量限。根據(jù)信噪比（S/N）=3確定檢出限，本方法的檢出限為0.000 3 mg·kg-1；信噪比（S/N）=10 確定定量限，本方法的定量限為0.001 mg·kg-1。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度

用空白的沃柑樣品分別進(jìn)行0.010 mg·kg-1、0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1共3 個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)3 次。表1 結(jié)果表明，回收率為82.7%～90.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～4.7%，其準(zhǔn)確度與精密度均符合GB/T 27417—2017[13]的要求。

表1 測定沃柑中2,4-滴準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本試驗(yàn)方法對(duì)從南寧各農(nóng)貿(mào)市場采購的8批次沃柑進(jìn)行測定，僅1 批檢測到2,4-滴，含量為0.36 mg·kg-1，檢出2,4-滴的樣品色譜圖見圖1。對(duì)該批次樣品已剝皮的果肉部分制樣后檢測，結(jié)果為未檢出。因此即便遇到檢出2,4-滴的樣品，實(shí)際生活中也無須擔(dān)心攝入問題。

圖1 檢出2,4-滴的樣品色譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化提取條件和衍生化試劑，建立了乙腈+萃取鹽包鹽析提取，正丁醇+濃硫酸衍生化后過柱測定沃柑中2,4-滴含量的方法。該方法與目前的國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，操作流程簡便，檢測成本低，靈敏度高，能滿足定量檢測的要求，為沃柑日常的大批量檢測提供了一種有效、便捷的方法。