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        探討基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)曲定量方式對(duì)餐飲食品中5 種生物堿定量結(jié)果的影響

        2023-07-09 04:41:36林曉明許琨琨蔡振世莊秋虹莊慶彬
        食品安全導(dǎo)刊 2023年15期

        林曉明,許琨琨,蔡振世,莊秋虹,莊慶彬

        (泉州市食品藥品檢驗(yàn)所,福建泉州 362000)

        以罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因等為主要成分[1]的罌粟殼中的多種生物堿可以讓食品增味提鮮,使顧客上癮,讓人嗜睡和性格改變,長(zhǎng)期食用會(huì)引起精神失常,出現(xiàn)幻覺(jué)甚至慢性中毒[2-3]。盡管我國(guó)法律明令禁止在食品中添加罌粟殼,有關(guān)部門(mén)對(duì)在食品中添加罌粟殼的行為采取高壓打擊態(tài)勢(shì),但某些不法商販,為了“回頭客”,利用罌粟殼的成癮特性,將其添加在羊肉湯、火鍋底料、麻辣燙等餐飲食品中,從而增加客流量,嚴(yán)重危害人們的身心健康[4-5]。

        目前,在5 種生物堿的檢測(cè)中,相比以往固相萃取法、氯仿萃取法等前處理方法,QuEChERS 前處理方法更快速、便捷、有效,廣泛應(yīng)用于多數(shù)檢測(cè)領(lǐng)域,也用于罌粟殼中多種生物堿的檢驗(yàn)檢測(cè)[3,6-7]。筆者發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方式會(huì)直接影響最終的定量結(jié)果,基于此對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和標(biāo)曲定量方式對(duì)5 種生物堿中的影響展開(kāi)研究探討,同時(shí)建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法,一次性同時(shí)檢測(cè)羊湯、火鍋湯和水煮魚(yú)湯等多種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿含量,以供參考。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與設(shè)備

        GM200 高 速 磨 碎 機(jī),Retsch;XSE205DU 電子天平,梅特勒托利多儀器有限公司;LPD2500 多管旋渦混合儀,萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司;LAB DANCER S25 漩渦混勻器,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;Tissuelyser-96LGM 多樣品組織研磨儀,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;3-15 離心機(jī),曦瑪離心機(jī)(揚(yáng)州)有限公司;TurboVap LV 全自動(dòng)氮吹儀,Biotage;Triple Quad 5500 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),美國(guó)愛(ài)博才思公司。

        1.2 材料與試劑

        樣品:羊湯、火鍋湯、水煮魚(yú)湯,均在泉州市區(qū)各小吃店的餐飲食品隨機(jī)采購(gòu)。

        試劑:乙腈(默克,色譜純);甲醇(默克,色譜純);甲酸(ROE,色譜純);乙酸銨(Fisher Chemical,色譜純)。鹽酸可待因(中檢院,批號(hào):171203-201808,100 mg);嗎啡(中檢院,批號(hào):171201-201825,100 mg);蒂巴因(中檢院,批號(hào):171216-201805,50 mg);那可?。ㄖ袡z院,批號(hào):171224-201605,100 mg);鹽酸罌粟堿(中檢院,批號(hào):171214-201906,100 mg);甲醇中可待因-D3 溶液(First Standard?,批號(hào):S107027,100 μg·mL-1); 甲 醇 中 嗎 啡-D3 溶 液(First Standard?,批號(hào):S102043,100 μg·mL-1)。

        材料:高效QuEChERS 樣品前處理試劑盒[青云化學(xué)科技有限公司,型號(hào):CQ11-3(萃取管+鹽包+凈化管),批號(hào):20230323-004]。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件

        (1)色譜條件。色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH HILIC(2.1 mm×150 mm,1.7 μm);流 動(dòng) 相:A 相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1乙酸銨溶液,B 相為0.1%甲酸乙腈溶液;梯度洗脫(見(jiàn)表1)。柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量:2 μL。

        表1 梯度洗脫程序

        (2)質(zhì)譜條件。離子源:ES(I電噴霧離子源),正離子模式采集;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM;氣簾氣(CUR):20 psi;離子化電壓(IS):5 500 V(正離子模式);溫度(TEM):500 ℃;噴霧氣(GS1):50 psi;輔助加熱氣(GS2):50 psi;各化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

        表2 5 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)

        1.3.2 對(duì)照品及樣品溶液的制備

        (1)混合對(duì)照品溶液的制備。對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱取嗎啡、鹽酸可待因(以下簡(jiǎn)稱可待因)、蒂巴因、那可丁和鹽酸罌粟堿(以下簡(jiǎn)稱罌粟堿)對(duì)照品適量,分別置于25 mL 容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成濃度均為100 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

        混合對(duì)照品溶液A:精密吸取嗎啡、可待因各1 000 μL 和那可丁、蒂巴因、罌粟堿各200 μL 于20 mL 容量瓶中,用乙腈定容至刻度,混勻,得嗎啡、可待因濃度為5 μg·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為1 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液A。

        混合對(duì)照品溶液B:精密吸取100 μL 混合對(duì)照品溶液A于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,混勻,得嗎啡、可待因濃度為50 ng·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為10 ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液B。

        同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液(5 μg·mL-1):精密吸取嗎啡-D3 和可待因-D3(對(duì)照品濃度均為100 μg·mL-1)各1 000 μL 置于20 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得嗎啡-D3 和可待因-D3 濃度均為5 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)溶液,備用。

        混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備:以乙腈為溶劑,精密吸取混合對(duì)照品溶液B 適量,逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度 為0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1的那可丁、蒂巴因、罌粟 堿 和 質(zhì) 量 濃 度 為1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、25.00 ng·mL-1的嗎啡、可待因混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,備用。

        (2)樣品溶液的制備。每種樣品平行稱取2 g(精確至0.01 g),分別置于50 mL CQ11-3 萃取管(內(nèi)含NaCl 500 mg)中,加入5 mL 水振搖混勻,再加入溶劑乙腈15 mL,渦旋振搖混勻1 min 左右,加入CQ11-3 鹽包(內(nèi)含MgSO45 g 和NaAc 2 g),劇烈振蕩1 min,用5 000 r·min-1離心機(jī)離心5 min,取上清液8 mL 至CQ11-3 凈化管(內(nèi)含PSA 300 mg、C18500 mg 和MgSO41 500 mg)中,渦旋混勻1 min 左右,再經(jīng)5 000 r·min-1離心機(jī)離心5 min,移取上清液適量經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜,按1.3.1 方法進(jìn)樣。

        (3)溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備。取5 支10 mL玻璃試管,均加入同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液(5 μg·mL-1)20 μL,再依次加入1 mL 相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,復(fù)溶混勻(見(jiàn)表3),過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,按1.3.1 方法進(jìn)樣。

        表3 溶劑/基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中各化合物濃度梯度

        (4)基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備。稱取3 種空白基質(zhì)樣品各2 g(精確至0.01 g),每種平行6 份。同樣品溶液的制備方法進(jìn)行提取和凈化,得空白基質(zhì)溶液,合并于50 mL 塑料離心管,再分別精確移取1 mL 置于5 支10 mL 玻璃試管中,40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑尤胪凰貎?nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液(5 μg·mL-1)20 μL,再依次加入1 mL 相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,復(fù)溶混勻(見(jiàn)表3),過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,按1.3.1 方法進(jìn)樣。

        (5)加標(biāo)回收及精密度測(cè)試。稱取3 種空白基質(zhì)樣品各2 g(精確至0.01 g),每種平行6 份。設(shè)置一個(gè)濃度水平加標(biāo)回收,分別加入20 μL 混合對(duì)照品溶液A 和300 μL 同位素內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照品工作溶液(5 μg·mL-1),同樣品溶液的制備方法進(jìn)行提取和凈化,按1.3.1 方法進(jìn)樣。

        (6)檢出限、定量限的確定。利用空白基質(zhì)添加5 種生物堿目標(biāo)化合物,以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)檢測(cè)濃度確定方法檢出限,以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的檢測(cè)濃度確定方法定量限。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍

        本實(shí)驗(yàn)方法得出的各目標(biāo)化合物的線性范圍如表4 所示,其中罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ~5.00 ng·mL-1,嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ~25.00 ng·mL-1,相關(guān)系數(shù)均在0.998 以上,說(shuō)明各目標(biāo)化合物的峰面積與進(jìn)樣濃度在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

        表4 5 種生物堿的線性范圍定量分析

        2.2 不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)分析

        按公式(1)分析基質(zhì)效應(yīng)影響,結(jié)果如表5 所示。由表5 可知,用高效QuEChERS 方法處理空白基質(zhì),5 種生物堿均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。其中,罌粟堿、那可丁、蒂巴因在外標(biāo)法定量分析中,3 種基質(zhì)中的|ME|≤0.22,基本呈現(xiàn)弱的基質(zhì)效應(yīng);嗎啡、可待因在外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)法定量中,3 種基質(zhì)中的|ME|均在0.2 ~0.5,呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng),同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)法定量分析加大了這種效應(yīng)趨勢(shì)。

        表5 5 種生物堿在3 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

        式中:ME為基質(zhì)效應(yīng);A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME>0,表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng);ME<0,表明基質(zhì)效應(yīng)抑制;|ME|=0表示不存在基質(zhì)效應(yīng);|ME|<0.2 為弱基質(zhì)效應(yīng);0.2 ≤|ME|≤0.5 為中等基質(zhì)效應(yīng);|ME|>0.5 為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[6]。

        2.3 不同標(biāo)曲定量分析加標(biāo)回收率

        從表6 可知,用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因在羊湯、火鍋湯、水煮魚(yú)湯中的加標(biāo)回收率情況,回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范,表明該高效QuEChERS前處理方法對(duì)罌粟堿、那可丁、蒂巴因3 種生物堿的提取效率較好。但可以發(fā)現(xiàn)基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量相較于溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量而言,回收率均有所上升,除了罌粟堿和那可丁在水煮魚(yú)湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度比較大,達(dá)到21%和27%,其余上升幅度均不超10%,影響相對(duì)有限。其中蒂巴因在火鍋湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度最低,僅有1%左右。這與2.2分析的基質(zhì)效應(yīng)抑制相對(duì)應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)越弱,兩種標(biāo)曲定量出來(lái)的回收率結(jié)果越接近,反之相差越大。由此可見(jiàn),使用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量罌粟堿、那可丁、蒂巴因相對(duì)準(zhǔn)確,但為了方便快捷,減少基質(zhì)空白前處理過(guò)程,參考實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求,由于罌粟堿、那可丁和蒂巴因基質(zhì)效應(yīng)偏弱,可以采取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析。

        表6 不同標(biāo)曲定量分析3 種基質(zhì)中5 種生物堿的加標(biāo)回收率、定量限、檢出限

        用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因在羊湯、火鍋湯、水煮魚(yú)湯中的加標(biāo)回收率情況,基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量能讓回收率上升幅度在25%~55%,但回收率結(jié)果均不足50%,未能有效滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范??梢?jiàn),即使嗎啡、可待因在3 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)影響較大,呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng),用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量仍未能滿足要求。而用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析,嗎啡的回收率在82%~85%,可待因的回收率在85%~87%,均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范。這與嗎啡、可待因在高效QuEChERS 前處理過(guò)程中損失有著密切聯(lián)系。據(jù)此,筆者提出該前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素,而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素。為此,采取了用基質(zhì)標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析了加標(biāo)回收情況,結(jié)果是嗎啡回收率范圍在123%~149%,可待因的回收率范圍在140%~149%,這可能是嗎啡-D3、可待因-D3 內(nèi)標(biāo)物校正了QuEChERS 前處理過(guò)程中目標(biāo)化合物的損失(含基質(zhì)效應(yīng)影響的部分)和基質(zhì)標(biāo)曲校正了基質(zhì)效應(yīng)影響的雙重疊加的結(jié)果,偏離了實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范范圍。由此可以得出,QuEChERS 前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素,基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量對(duì)其改善不足,用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析較為可靠,也相對(duì)方便快捷。

        2.4 方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果分析

        按2.3 分析,本文針對(duì)罌粟堿、那可丁和蒂巴因選取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析,嗎啡、可待因選取溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析,確定該方法的方法學(xué)參數(shù)的可靠性。從表4 可知,罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ~5.00 ng·mL-1,嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ~25.00 ng·mL-1,相關(guān)系數(shù)均在0.998 以上。從表6 可知,5 種生物堿在3 種基質(zhì)中的定量限和檢出限均較低,在羊湯、火鍋湯、水煮魚(yú)湯中的定量限位于0.08 ~4.50 μg·kg-1,檢出限位于0.02 ~1.35 μg·kg-1。從表7 可知,5 種生物堿在羊湯、火鍋湯、水煮魚(yú)湯中加標(biāo)回收率在69%~88%,RSD 在0.2%~5.5%。由此可見(jiàn),此方法具有較低的定量限、檢出限,在線性范圍內(nèi)各目標(biāo)化合物的相關(guān)性良好,同時(shí)具有較好準(zhǔn)確度和精密度。

        表7 5 種生物堿準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果(n=6)

        3 結(jié)論

        本文對(duì)比分析了5 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚(yú)湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱,同時(shí)用溶劑外標(biāo)法、基質(zhì)外標(biāo)法、溶劑內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法4 種不同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量分析加標(biāo)樣品,指出罌粟堿、那可丁和蒂巴因3 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚(yú)湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)抑制較弱,溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量結(jié)果均能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范;而嗎啡和可待因2 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚(yú)湯基質(zhì)中受到的基質(zhì)效應(yīng)抑制為中等強(qiáng)度,考慮高效QuEChERS 前處理是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素,而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素,經(jīng)過(guò)對(duì)比分析只有溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果表明,可以不考慮不同基質(zhì)對(duì)5 種生物堿的影響,采用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因,采用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因,建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法,一次性同時(shí)檢測(cè)羊湯、火鍋湯和水煮魚(yú)湯3 種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿的含量。該方法的靈敏度高,準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好,操作簡(jiǎn)便、快速,可為市場(chǎng)監(jiān)管相關(guān)餐飲食品中罌粟殼生物堿殘留量提供思路。

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