龔高進(jìn) 范海泉 江洋 黃海汛

(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院脊柱骨科,四川 成都 610000)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病,可導(dǎo)致持續(xù)的關(guān)節(jié)疼痛和功能喪失[1]。OA期間,炎癥介質(zhì)如白介素(IL)-1β、IL-6和單核細(xì)胞螯合蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein,MCP-1)的水平增加,導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)表達(dá)上調(diào)和Ⅱ型膠原蛋白(COL2A1)等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)成分表達(dá)降低,最終引起關(guān)節(jié)軟骨破壞[2-3]。鋅指蛋白(Zinc-fingers,ZNF)是一種含鋅離子的金屬蛋白,是真核生物中研究最充分的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4]。證據(jù)[5]表明,某些種類的ZNF可能在多種疾病類型中發(fā)揮關(guān)鍵的病理生理作用,包括OA。與未檢測到或輕度關(guān)節(jié)突(Facet joint)OA患者相比,miR-181a-5p和miR-4454在中度至重度關(guān)節(jié)突OA患者的FJ軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并通過靶向ZNF440來介導(dǎo)下游的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號,促進(jìn)OA關(guān)節(jié)退化的發(fā)生發(fā)展[6]。然而,ZNF440在膝關(guān)節(jié)(Knee)OA病理過程中對關(guān)節(jié)軟骨退化的整體作用在很大程度上是未知的。本研究利用人類膝關(guān)節(jié)OA軟骨確定ZNF440的表達(dá),并探索其在膝關(guān)節(jié)OA軟骨退行性病變中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 抗ZNF400抗體(Abcam,ab66849,美國);山羊抗兔IgG熒光抗體(Sant,sc2749,美國);抗PARP p85抗體(Promega,G734,美國);抗β-actin抗體(Sigma,A1978,美國);ZNF400 siRNA(Santa,sc97725,美國);人重組IL-1β(R&D systems,201-LB美國);Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,13778075,美國)。

1.2 人Knee軟骨的獲取和分級 Knee OA軟骨來源于接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(Total Knee Arthroplasty,TKR)的患者,OA影像學(xué)嚴(yán)重程度由Kellgren-Lawrence分級法[7]確定。Ⅲ和Ⅳ級患者的軟骨樣本作為Knee OA組;對照組軟骨樣本來自接受TKR手術(shù)的患者外側(cè)髁未受損區(qū)域。Knee軟骨的退化程度由OARSI評分[8]來評估。通過組織病理學(xué)染色分析進(jìn)一步確定對照組和Knee OA組軟骨變性程度。提供膝關(guān)節(jié)軟骨樣本的患者基本特征,見表1。

1.3 番紅O-固綠(Safranin O-Fast Green)染色檢測軟骨退變程度 Knee軟骨樣本在福爾馬林中固定至少72 h后,在0.5 mol/L鹽酸和0.1%戊二醛中脫鈣7 d,石蠟固定包埋,連續(xù)切片(5 μm)。用Safranin O和Fast Green分別染色,并使用OARSI評分進(jìn)行評估。

1.4 免疫組化檢測ZNF400表達(dá) 石蠟切片在二甲苯中脫蠟后,梯度酒精中復(fù)水。用1% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫5 min。0.1% BSA孵育30 min,阻斷非特異性IgG結(jié)合。ZNF400一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜。次日,PBS清洗2次,二抗孵育30 min,顯色后封片。

1.5 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取對照組患者適量關(guān)節(jié)軟骨組織,兩步酶法消化后傳代培養(yǎng):無菌培養(yǎng)皿中PBS緩沖液沖洗軟骨組織數(shù)次后將其剪碎;胰蛋白酶(0.25%)充分消化后恒溫震蕩40 min孵育,1000 r/min離心后棄上清。加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮原代軟骨細(xì)胞,調(diào)整密度為108/L并接種于培養(yǎng)瓶,37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。留取第2代、第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組與處理 將正常人軟骨細(xì)胞消化、重懸、計數(shù)、鋪六孔板,細(xì)胞密度為1×105個細(xì)胞/mL。建立無IL-1β刺激組(IL-1β-組)和有IL-1β刺激組(IL-1β+組),IL-1β+組給予人軟骨細(xì)胞重組人IL-1β(10 ng/mL)刺激18 h(模擬OA表型),IL-1β-組僅給予等量PBS處理。

1.7 ZNF440過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞 按照說明書,用攜帶對照-綠色熒光蛋白(CTL-GFP)或ZNF440-GFP過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒轉(zhuǎn)染IL-1β+組和IL-1β-組細(xì)胞,分別建立CTL-GFP(對照)組和ZNF440-GFP組。方法如下:重懸軟骨細(xì)胞(1×105個細(xì)胞/mL)并用慢病毒(MOI 2.5)轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板中,培養(yǎng)24 h。3 d后用2 mL含嘌呤霉素(0.5 μg/mL)的完全培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,并將細(xì)胞培養(yǎng)至融合,轉(zhuǎn)染CTL-GFP或ZNF440-GFP。使用EVOS FL成像系統(tǒng)對GFP信號進(jìn)行可視化分析。收集轉(zhuǎn)染GFP的軟骨細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測GFP轉(zhuǎn)染的陽性率,推算慢病毒感染效率。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用7-AAD PE Annexin V凋亡檢測試劑盒,檢測人軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。軟骨細(xì)胞(2×105細(xì)胞/孔)用0.05%胰蛋白酶消化,PBS洗滌2次。將細(xì)胞用細(xì)胞染色緩沖液重懸后,與PE Annexin V/7-AAD在室溫黑暗下孵育30 min,加入400 μL結(jié)合緩沖液。數(shù)據(jù)在FACSCanto Ⅱ(BD)上獲得,并用FlowJo進(jìn)行分析。

1.9 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 IL-1β+組和IL-1β-組細(xì)胞均使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(10 nmol/L)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染ZNF440-siRNA或陰性對照(NC)-siRNA(50 nmol/L)48 h,分別建立ZNF440-siRNA組和NC-siRNA組。

1.10 RNA提取和定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)檢測炎癥、合成分解代謝和凋亡相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá) 使用TRIZOL一步法提取軟骨或體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中分離總RNA,然后使用RNeasy Mini kits (Qiagen)進(jìn)行純化。檢測RNA的純度及濃度后,采用一步RT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)試劑配制:5X QIAGEN一步RT-PCR緩沖液10 μL、dNTP 混合物2 μL、QIAGEN一步RT-PCR酶混合物2 μL、上下游引物各1 μL、RNA 1 μg和無酶水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件:逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min、預(yù)變性95 ℃ 15 min,變性94 ℃ 30 s,退火56 ℃ 60 s,延伸72 ℃ 60 s,變性、退火、延伸設(shè)置40個循環(huán),終延伸72 ℃ 10 min。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。所有引物都是用Primer3Plus(http:// primer3plus.com)設(shè)計的。各RNA的表達(dá)以GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,用2-ΔΔCt法計算PCR產(chǎn)物的相對表達(dá)量。引物序列,見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物基因序列Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer gene sequence

1.11 Western blotting(WB)檢測聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)p85 和ZNF440蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液,冰上裂解,獲得細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,電濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h,用兔多克隆IgG一抗:PARP p85 (1∶500),ZNF440 (1∶3000)或β-actin(1∶1000)抗體,孵育過夜,然后與二抗(1∶10000)在5%脫脂牛奶-TBS中在4 ℃下孵育1.5 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶,Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度分析。

1.12 生物信息學(xué)分析 通過文獻(xiàn)檢索和對Connectivity Map 02 (CMAP)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析,確定有可能下調(diào)ZNF440表達(dá)的化合物[9]。對CMAP數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以確定CMAP中單個化合物引起的ZNF440表達(dá)的倍數(shù)變化:在單個化合物的所有實(shí)例中計算平均倍數(shù)變化,選出了能使ZNF440平均表達(dá)量減少至少1.5倍的化合物,其中包括Scriptaid,進(jìn)行化合物驗(yàn)證,在給予IL-1β+組和IL-1β-組細(xì)胞Scriptaid(0～10,000 nmol/L)處理72 h。建立IL-1β+Scriptaid(1000 nmol/L)組、ZNF440-GFP+Scriptaid(1000 nmol/L)組和對照組,方法同上,對照組僅給予等量二甲基亞砜(DMSO)處理。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織番紅O-固綠染色 番紅O-固綠染色顯示,對照組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,著色均勻;而Knee OA組軟骨嚴(yán)重退化,表現(xiàn)為組織淡染,伴有裂隙和變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,排列紊亂,見圖1。

圖1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織番紅O-固綠染色(100×)Figure 1 Knee cartilage tissue stained with safranin O-fast green

2.2 ZNF440在膝關(guān)節(jié)OA軟骨中的表達(dá) 采用免疫組化和WB檢測OA軟骨組織中ZNF440的表達(dá)。Knee OA組軟骨組織中表達(dá)ZNF440的陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著增加(P<0.05)(見圖2A);WB進(jìn)一步顯示,Knee OA組軟骨組織ZNF440蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05),見圖2B。

圖2 ZNF440在Knee OA軟骨中的表達(dá)Figure 2 Expression of ZNF440 in Knee OA cartilage注:A.免疫組化(100×);B.Western blotting。與對照組相比,①P<0.01。

2.3 ZNF440過表達(dá)對Knee OA細(xì)胞炎癥、軟骨分解和合成代謝標(biāo)志物影響 通過給予IL-1β刺激軟骨細(xì)胞模擬OA環(huán)境,CTL-GFP組和ZNF440-GFP組之間IL-6和MCP1基因表達(dá)差異無統(tǒng)計意義(P>0.05);與CTL-GFP組相比,ZNF440-GFP組細(xì)胞無論有(+)或無(-)IL-1β刺激,MMP13表達(dá)均明顯增加,而COL2A1表達(dá)顯著減少,這些效果在有IL-1β(+)刺激時表現(xiàn)更明顯(P<0.01)。見圖3。

圖3 qPCR檢測ZNF440過表達(dá)對OA軟骨細(xì)胞炎癥、軟骨分解和合成代謝標(biāo)志物的影響Figure 3 Effect of ZNF440 overexpression on inflammation, chondrolysis and anabolic markers in OA chondrocytes by qPCR注:與CTL-GFP組相比,①P<0.05, ②P<0.01;與無IL-1β刺激的CTL-GFP組相比,③P<0.05,④P<0.01;與有IL-1β刺激的CTL-GFP組相比,⑤P<0.05, ⑥P<0.01。

2.4 ZNF440過表達(dá)對Knee OA細(xì)胞凋亡的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Knee軟骨細(xì)胞在ZNF440-GFP過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡。與CTL-GFP組相比,ZNF440-GFP組軟骨細(xì)胞有更大比例的AnnexinV/7-AAD雙陽性細(xì)胞(P<0.01)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Figure 4 Flow cytometry detection of apoptosis注:A.在CTL-或ZNF440-GFP轉(zhuǎn)染后,對Knee OA組Annexin V/7-AAD雙陽性細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析;B.統(tǒng)計陽性細(xì)胞占比。與CTL-GFP組相比,①P<0.01。

2.5 siRNA敲除ZNF440對軟骨炎癥、分解合成代謝和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)的影響 與無IL-1β刺激組的NC-siRNA相比,有IL-1β刺激組均可誘導(dǎo)MMP13、IL-6、MCP1和PARP p85的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。IL-1β(+)刺激下,ZNF440-siRNA組中MMP13、IL6、MCP1和PARP p85表達(dá)均較NC-siRNA顯著降低(P<0.05)。然而,無論有或無IL-1β刺激,NC-siRNA組和ZNF440-siRNA組之間COL2A1表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 敲除ZNF440在OA軟骨細(xì)胞中的效果Figure 5 Effect of knockdown of ZNF440 in OA chondrocytes注:A.qPCR評估軟骨細(xì)胞MMP13、IL6、MCP1和COL2A1的mRNA表達(dá)。B.WB檢測軟骨細(xì)胞PARP p85蛋白表達(dá)。與NC-siRNA相比,①P<0.05,②P<0.01。與無IL-1β刺激NC-siRNA相比, ③P<0.05;與有IL-1β刺激NC-siRNA相比,④P<0.01。

2.6 Scriptaid處理對OA軟骨分解代謝、炎癥和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)的影響 Scriptaid(10～1000 nmol/L)處理以濃度梯度的方式抑制Knee OA軟骨細(xì)胞ZNF440的表達(dá),并在1000 nmol/L濃度達(dá)到最大抑制率(P<0.05)。qPCR結(jié)果顯示,有IL-1β刺激時,與對照組相比,Scriptaid組MMP13、IL6和MCP1的mRNA表達(dá)以及PARP p85的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。無IL-1β刺激時,Scriptaid組和對照組以上各基因表達(dá)無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖6。

圖6 驗(yàn)證可抑制OA軟骨細(xì)胞ZNF440表達(dá)化合物Scriptaid的作用Figure 6 Validation of the inhibition of the expression of the compound Scriptaid by OA chondrocytes ZNF440注:A.Scriptaid對ZNF440在軟骨細(xì)胞中表達(dá)的影響(Scr 0, 10, 100, 1000 nmol/L)。B.qPCR評估軟骨細(xì)胞中MMP13、IL6和MCP1的mRNA表達(dá)。C.WB檢測PARP p85蛋白表達(dá)。與對照組相比,①P<0.05,②P<0.01;與無IL-1β刺激對照組相比,③P<0.01;與無IL-1β刺激的Scr(1000 nmol/L)組相比,④P<0.01。

2.7 Scriptaid通過靶向降低ZNF440的表達(dá)發(fā)揮作用 給予Scriptaid組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF440-GFP過表達(dá)質(zhì)粒,檢測Scriptaid是否通過ZNF440影響軟骨分解代謝和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)。結(jié)果顯示,與ZNF440 GFP組相比,ZNF440-GFP+Scriptaid組MMP13和PARP p85的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。然而,各組間COL2A1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 Scriptaid通過直接降低ZNF440表達(dá)發(fā)揮作用Figure 7 Scriptaid acts by directly reducing the expression of ZNF440注:A、B.qPCR檢測Scriptaid對MMP13和COL2A1表達(dá)的影響。C.WB檢測Scriptaid對PARP p85蛋白表達(dá)的影響。與ZNF440 GFP組相比,①P<0.01。

3 討論

OA是一種累及關(guān)節(jié)軟骨和滑膜關(guān)節(jié)周圍組織的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)惡化疾病,是最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10]。OA多累及頸椎、腰椎、手、膝、髖關(guān)節(jié)等,其中膝關(guān)節(jié)是最復(fù)雜、最脆弱的負(fù)重關(guān)節(jié)[11]。有研究[12-14]發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞相關(guān)的有害變化在膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。盡管對膝關(guān)節(jié)OA具有深刻的認(rèn)識,但臨床研究人員仍在努力探索OA發(fā)病機(jī)制背后的關(guān)鍵原因。本研究發(fā)現(xiàn)Scriptaid是一種小分子藥物,能夠下調(diào)人OA軟骨細(xì)胞中ZNF440的表達(dá),并減少ZNF440誘導(dǎo)的軟骨破壞和凋亡。

盡管之前還尚少研究報道ZNF440在軟骨變性中的作用,但其他類型的ZNF蛋白已被證明可在軟骨變性和形成中發(fā)揮重要作用[15-17]。ZNF440是一種在靈長類動物包括人類、黑猩猩和猴子中發(fā)現(xiàn)的C2H2型蛋白。研究[6]發(fā)現(xiàn),在中重度脊柱小關(guān)節(jié)軟骨OA患者中,NF440表達(dá)增加,而降低ZNF440的表達(dá)水平可引起NF-κB-p65磷酸化下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn),ZNF440在Knee OA組軟骨中的表達(dá)顯著高于對照組(非退變)軟骨,這說明OA可導(dǎo)致ZNF440表達(dá)上調(diào)。

多種炎癥介質(zhì)在OA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,研究[2,18-19]發(fā)現(xiàn),OA期間IL-1β在OA患者的滑膜和軟骨組織中普遍高表達(dá),并可刺激MMP-1,MMP-3和MMP-13的釋放,誘導(dǎo)IL-6、IL-8、MCP-1和CCL5等趨化因子的產(chǎn)生。本研究結(jié)果說明ZNF440在OA的發(fā)生發(fā)展過程中軟骨細(xì)胞的損傷和退行性作用起到促進(jìn)作用,其機(jī)制可能與ZNF440促進(jìn)炎癥反應(yīng)和分解代謝有關(guān)。早期研究[20]發(fā)現(xiàn),OA軟骨細(xì)胞可發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,而且凋亡比例高于正常組織,提示骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡是一種可能的OA病理途徑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與CTL-GFP轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞相比,ZNF440-GFP轉(zhuǎn)染的Knee OA軟骨細(xì)胞中PARP p85蛋白表達(dá)和Annex-inV/7-AAD雙陽性細(xì)胞量明顯增加。這些結(jié)果表明,ZNF440在OA的病理過程中具有促凋亡作用,抑制ZNF440的表達(dá)可能有助于延緩OA的發(fā)生發(fā)展。

在OA的病理過程中,IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶能夠降解軟骨,是OA發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動因素[21-22],此外,ZNF440的表達(dá)在IL-1β刺激下可顯著增加[5]。基于此,本研究通過給予IL-1β刺激膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立OA體外模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZNF440過表達(dá)軟骨細(xì)胞中MMP13、IL6、MCP1、PARP p85表達(dá)和Annex-inV/7-AAD陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,這些效果在IL-1β刺激后表現(xiàn)更明顯。然而,敲除ZNF440可顯著逆轉(zhuǎn)OA軟骨細(xì)胞中IL-1β引起的損傷作用。這些結(jié)果說明促炎因子IL-1β在ZNF440表達(dá)和功能方面發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

鑒于ZNF440可能是與OA相關(guān)的分解代謝過程調(diào)節(jié)器,本研究利用Connectivity Map篩選化合物,通過qPCR驗(yàn)證,并確定了Scriptaid可以減少ZNF440在人膝關(guān)節(jié)OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。Scriptaid是一種廣譜的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi),主要功能是抑制Ⅱ類(a)HDACs[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用Scriptaid干預(yù)可明顯減少ZNF440高表達(dá)的人膝關(guān)節(jié)OA軟骨細(xì)胞中分解代謝和凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。有研究[6]發(fā)現(xiàn)ZNF440可部分調(diào)控人類關(guān)節(jié)突軟骨細(xì)胞中的NF-κB-p65(p-p65)表達(dá),因此,ZNF440可能通過改變p-p65的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。與此相一致,Ji等[24]發(fā)現(xiàn),在小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5中,IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)可以通過降低p-p65的水平而減弱。然而,ZNF440在促進(jìn)炎癥和細(xì)胞凋亡方面的確切作用需要在未來的研究中進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

ZNF440在人Knee OA軟骨中表達(dá)增加,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中炎癥、分解代謝和凋亡標(biāo)志物的表達(dá)參與軟骨退行性機(jī)制。小分子化合物Scriptaid可降低ZNF440的表達(dá),并抑制其在OA軟骨細(xì)胞中的破壞作用,可能成為臨床治療OA患者的新型藥物。