龔高進 范海泉 江洋 黃海汛

(成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院脊柱骨科,四川 成都 610000)

骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是最常見的退行性關節(jié)疾病,可導致持續(xù)的關節(jié)疼痛和功能喪失[1]。OA期間,炎癥介質(zhì)如白介素(IL)-1β、IL-6和單核細胞螯合蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein,MCP-1)的水平增加,導致基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)表達上調(diào)和Ⅱ型膠原蛋白(COL2A1)等軟骨細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)成分表達降低,最終引起關節(jié)軟骨破壞[2-3]。鋅指蛋白(Zinc-fingers,ZNF)是一種含鋅離子的金屬蛋白,是真核生物中研究最充分的轉錄因子家族之一[4]。證據(jù)[5]表明,某些種類的ZNF可能在多種疾病類型中發(fā)揮關鍵的病理生理作用,包括OA。與未檢測到或輕度關節(jié)突(Facet joint)OA患者相比,miR-181a-5p和miR-4454在中度至重度關節(jié)突OA患者的FJ軟骨細胞中表達上調(diào),并通過靶向ZNF440來介導下游的核轉錄因子(NF-κB)信號,促進OA關節(jié)退化的發(fā)生發(fā)展[6]。然而,ZNF440在膝關節(jié)(Knee)OA病理過程中對關節(jié)軟骨退化的整體作用在很大程度上是未知的。本研究利用人類膝關節(jié)OA軟骨確定ZNF440的表達,并探索其在膝關節(jié)OA軟骨退行性病變中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 抗ZNF400抗體(Abcam,ab66849,美國);山羊抗兔IgG熒光抗體(Sant,sc2749,美國);抗PARP p85抗體(Promega,G734,美國);抗β-actin抗體(Sigma,A1978,美國);ZNF400 siRNA(Santa,sc97725,美國);人重組IL-1β(R&D systems,201-LB美國);Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen,13778075,美國)。

1.2 人Knee軟骨的獲取和分級 Knee OA軟骨來源于接受全膝關節(jié)置換術(Total Knee Arthroplasty,TKR)的患者,OA影像學嚴重程度由Kellgren-Lawrence分級法[7]確定。Ⅲ和Ⅳ級患者的軟骨樣本作為Knee OA組;對照組軟骨樣本來自接受TKR手術的患者外側髁未受損區(qū)域。Knee軟骨的退化程度由OARSI評分[8]來評估。通過組織病理學染色分析進一步確定對照組和Knee OA組軟骨變性程度。提供膝關節(jié)軟骨樣本的患者基本特征,見表1。

1.3 番紅O-固綠(Safranin O-Fast Green)染色檢測軟骨退變程度 Knee軟骨樣本在福爾馬林中固定至少72 h后,在0.5 mol/L鹽酸和0.1%戊二醛中脫鈣7 d,石蠟固定包埋,連續(xù)切片(5 μm)。用Safranin O和Fast Green分別染色,并使用OARSI評分進行評估。

1.4 免疫組化檢測ZNF400表達 石蠟切片在二甲苯中脫蠟后,梯度酒精中復水。用1% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫5 min。0.1% BSA孵育30 min,阻斷非特異性IgG結合。ZNF400一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜。次日,PBS清洗2次,二抗孵育30 min,顯色后封片。

1.5 軟骨細胞的分離與培養(yǎng) 取對照組患者適量關節(jié)軟骨組織,兩步酶法消化后傳代培養(yǎng):無菌培養(yǎng)皿中PBS緩沖液沖洗軟骨組織數(shù)次后將其剪碎;胰蛋白酶(0.25%)充分消化后恒溫震蕩40 min孵育,1000 r/min離心后棄上清。加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮原代軟骨細胞,調(diào)整密度為108/L并接種于培養(yǎng)瓶,37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。留取第2代、第3代細胞進行實驗。

1.6 細胞實驗分組與處理 將正常人軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)、鋪六孔板,細胞密度為1×105個細胞/mL。建立無IL-1β刺激組(IL-1β-組)和有IL-1β刺激組(IL-1β+組),IL-1β+組給予人軟骨細胞重組人IL-1β(10 ng/mL)刺激18 h(模擬OA表型),IL-1β-組僅給予等量PBS處理。

1.7 ZNF440過表達質(zhì)粒轉染人軟骨細胞 按照說明書,用攜帶對照-綠色熒光蛋白(CTL-GFP)或ZNF440-GFP過表達質(zhì)粒的慢病毒轉染IL-1β+組和IL-1β-組細胞,分別建立CTL-GFP(對照)組和ZNF440-GFP組。方法如下:重懸軟骨細胞(1×105個細胞/mL)并用慢病毒(MOI 2.5)轉染,將細胞轉移到6孔板中,培養(yǎng)24 h。3 d后用2 mL含嘌呤霉素(0.5 μg/mL)的完全培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,并將細胞培養(yǎng)至融合,轉染CTL-GFP或ZNF440-GFP。使用EVOS FL成像系統(tǒng)對GFP信號進行可視化分析。收集轉染GFP的軟骨細胞,流式細胞儀檢測GFP轉染的陽性率,推算慢病毒感染效率。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 采用7-AAD PE Annexin V凋亡檢測試劑盒,檢測人軟骨細胞凋亡和細胞死亡。軟骨細胞(2×105細胞/孔)用0.05%胰蛋白酶消化,PBS洗滌2次。將細胞用細胞染色緩沖液重懸后,與PE Annexin V/7-AAD在室溫黑暗下孵育30 min,加入400 μL結合緩沖液。數(shù)據(jù)在FACSCanto Ⅱ(BD)上獲得,并用FlowJo進行分析。

1.9 siRNA細胞轉染 IL-1β+組和IL-1β-組細胞均使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(10 nmol/L)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中轉染ZNF440-siRNA或陰性對照(NC)-siRNA(50 nmol/L)48 h,分別建立ZNF440-siRNA組和NC-siRNA組。

1.10 RNA提取和定量實時PCR(qRT-PCR)檢測炎癥、合成分解代謝和凋亡相關標志物的表達 使用TRIZOL一步法提取軟骨或體外培養(yǎng)的軟骨細胞中分離總RNA,然后使用RNeasy Mini kits (Qiagen)進行純化。檢測RNA的純度及濃度后,采用一步RT-PCR試劑盒配制反應體系進行qRT-PCR擴增。反應試劑配制:5X QIAGEN一步RT-PCR緩沖液10 μL、dNTP 混合物2 μL、QIAGEN一步RT-PCR酶混合物2 μL、上下游引物各1 μL、RNA 1 μg和無酶水補足20 μL。反應條件:逆轉錄50 ℃ 30 min、預變性95 ℃ 15 min,變性94 ℃ 30 s,退火56 ℃ 60 s,延伸72 ℃ 60 s,變性、退火、延伸設置40個循環(huán),終延伸72 ℃ 10 min。每個樣品設置3個重復。所有引物都是用Primer3Plus(http:// primer3plus.com)設計的。各RNA的表達以GAPDH進行標準化處理,用2-ΔΔCt法計算PCR產(chǎn)物的相對表達量。引物序列,見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物基因序列Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer gene sequence

1.11 Western blotting(WB)檢測聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)p85 和ZNF440蛋白表達 收集細胞,加入RIPA蛋白裂解液,冰上裂解,獲得細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,電濕轉將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h,用兔多克隆IgG一抗:PARP p85 (1∶500),ZNF440 (1∶3000)或β-actin(1∶1000)抗體,孵育過夜,然后與二抗(1∶10000)在5%脫脂牛奶-TBS中在4 ℃下孵育1.5 h。采用ECL化學發(fā)光法顯示蛋白條帶,Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.12 生物信息學分析 通過文獻檢索和對Connectivity Map 02 (CMAP)基因表達數(shù)據(jù)的分析,確定有可能下調(diào)ZNF440表達的化合物[9]。對CMAP數(shù)據(jù)進行處理,以確定CMAP中單個化合物引起的ZNF440表達的倍數(shù)變化:在單個化合物的所有實例中計算平均倍數(shù)變化,選出了能使ZNF440平均表達量減少至少1.5倍的化合物,其中包括Scriptaid,進行化合物驗證,在給予IL-1β+組和IL-1β-組細胞Scriptaid(0～10,000 nmol/L)處理72 h。建立IL-1β+Scriptaid(1000 nmol/L)組、ZNF440-GFP+Scriptaid(1000 nmol/L)組和對照組,方法同上,對照組僅給予等量二甲基亞砜(DMSO)處理。

2 結果

2.1 膝關節(jié)軟骨組織番紅O-固綠染色 番紅O-固綠染色顯示,對照組膝關節(jié)軟骨表面光滑,著色均勻;而Knee OA組軟骨嚴重退化,表現(xiàn)為組織淡染,伴有裂隙和變薄,軟骨細胞數(shù)量減少,排列紊亂,見圖1。

圖1 膝關節(jié)軟骨組織番紅O-固綠染色(100×)Figure 1 Knee cartilage tissue stained with safranin O-fast green

2.2 ZNF440在膝關節(jié)OA軟骨中的表達 采用免疫組化和WB檢測OA軟骨組織中ZNF440的表達。Knee OA組軟骨組織中表達ZNF440的陽性細胞數(shù)量較對照組顯著增加(P<0.05)(見圖2A);WB進一步顯示,Knee OA組軟骨組織ZNF440蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05),見圖2B。

圖2 ZNF440在Knee OA軟骨中的表達Figure 2 Expression of ZNF440 in Knee OA cartilage注:A.免疫組化(100×);B.Western blotting。與對照組相比,①P<0.01。

2.3 ZNF440過表達對Knee OA細胞炎癥、軟骨分解和合成代謝標志物影響 通過給予IL-1β刺激軟骨細胞模擬OA環(huán)境,CTL-GFP組和ZNF440-GFP組之間IL-6和MCP1基因表達差異無統(tǒng)計意義(P>0.05);與CTL-GFP組相比,ZNF440-GFP組細胞無論有(+)或無(-)IL-1β刺激,MMP13表達均明顯增加,而COL2A1表達顯著減少,這些效果在有IL-1β(+)刺激時表現(xiàn)更明顯(P<0.01)。見圖3。

圖3 qPCR檢測ZNF440過表達對OA軟骨細胞炎癥、軟骨分解和合成代謝標志物的影響Figure 3 Effect of ZNF440 overexpression on inflammation, chondrolysis and anabolic markers in OA chondrocytes by qPCR注:與CTL-GFP組相比,①P<0.05, ②P<0.01;與無IL-1β刺激的CTL-GFP組相比,③P<0.05,④P<0.01;與有IL-1β刺激的CTL-GFP組相比,⑤P<0.05, ⑥P<0.01。

2.4 ZNF440過表達對Knee OA細胞凋亡的影響 通過流式細胞術檢測Knee軟骨細胞在ZNF440-GFP過表達質(zhì)粒轉染后的細胞凋亡。與CTL-GFP組相比,ZNF440-GFP組軟骨細胞有更大比例的AnnexinV/7-AAD雙陽性細胞(P<0.01)。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測細胞凋亡Figure 4 Flow cytometry detection of apoptosis注:A.在CTL-或ZNF440-GFP轉染后,對Knee OA組Annexin V/7-AAD雙陽性細胞進行流式細胞術分析;B.統(tǒng)計陽性細胞占比。與CTL-GFP組相比,①P<0.01。

2.5 siRNA敲除ZNF440對軟骨炎癥、分解合成代謝和細胞凋亡標志物表達的影響 與無IL-1β刺激組的NC-siRNA相比,有IL-1β刺激組均可誘導MMP13、IL-6、MCP1和PARP p85的表達水平上調(diào)(P<0.05)。IL-1β(+)刺激下,ZNF440-siRNA組中MMP13、IL6、MCP1和PARP p85表達均較NC-siRNA顯著降低(P<0.05)。然而,無論有或無IL-1β刺激,NC-siRNA組和ZNF440-siRNA組之間COL2A1表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 敲除ZNF440在OA軟骨細胞中的效果Figure 5 Effect of knockdown of ZNF440 in OA chondrocytes注:A.qPCR評估軟骨細胞MMP13、IL6、MCP1和COL2A1的mRNA表達。B.WB檢測軟骨細胞PARP p85蛋白表達。與NC-siRNA相比,①P<0.05,②P<0.01。與無IL-1β刺激NC-siRNA相比, ③P<0.05;與有IL-1β刺激NC-siRNA相比,④P<0.01。

2.6 Scriptaid處理對OA軟骨分解代謝、炎癥和細胞凋亡標志物表達的影響 Scriptaid(10～1000 nmol/L)處理以濃度梯度的方式抑制Knee OA軟骨細胞ZNF440的表達,并在1000 nmol/L濃度達到最大抑制率(P<0.05)。qPCR結果顯示,有IL-1β刺激時,與對照組相比,Scriptaid組MMP13、IL6和MCP1的mRNA表達以及PARP p85的蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。無IL-1β刺激時,Scriptaid組和對照組以上各基因表達無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖6。

圖6 驗證可抑制OA軟骨細胞ZNF440表達化合物Scriptaid的作用Figure 6 Validation of the inhibition of the expression of the compound Scriptaid by OA chondrocytes ZNF440注:A.Scriptaid對ZNF440在軟骨細胞中表達的影響(Scr 0, 10, 100, 1000 nmol/L)。B.qPCR評估軟骨細胞中MMP13、IL6和MCP1的mRNA表達。C.WB檢測PARP p85蛋白表達。與對照組相比,①P<0.05,②P<0.01;與無IL-1β刺激對照組相比,③P<0.01;與無IL-1β刺激的Scr(1000 nmol/L)組相比,④P<0.01。

2.7 Scriptaid通過靶向降低ZNF440的表達發(fā)揮作用 給予Scriptaid組細胞轉染ZNF440-GFP過表達質(zhì)粒,檢測Scriptaid是否通過ZNF440影響軟骨分解代謝和細胞凋亡標志物表達。結果顯示,與ZNF440 GFP組相比,ZNF440-GFP+Scriptaid組MMP13和PARP p85的表達顯著降低(P<0.05)。然而,各組間COL2A1的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 Scriptaid通過直接降低ZNF440表達發(fā)揮作用Figure 7 Scriptaid acts by directly reducing the expression of ZNF440注:A、B.qPCR檢測Scriptaid對MMP13和COL2A1表達的影響。C.WB檢測Scriptaid對PARP p85蛋白表達的影響。與ZNF440 GFP組相比,①P<0.01。

3 討論

OA是一種累及關節(jié)軟骨和滑膜關節(jié)周圍組織的慢性進行性關節(jié)惡化疾病,是最常見的退行性關節(jié)疾病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。OA多累及頸椎、腰椎、手、膝、髖關節(jié)等,其中膝關節(jié)是最復雜、最脆弱的負重關節(jié)[11]。有研究[12-14]發(fā)現(xiàn),軟骨細胞相關的有害變化在膝關節(jié)OA的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。盡管對膝關節(jié)OA具有深刻的認識,但臨床研究人員仍在努力探索OA發(fā)病機制背后的關鍵原因。本研究發(fā)現(xiàn)Scriptaid是一種小分子藥物,能夠下調(diào)人OA軟骨細胞中ZNF440的表達,并減少ZNF440誘導的軟骨破壞和凋亡。

盡管之前還尚少研究報道ZNF440在軟骨變性中的作用,但其他類型的ZNF蛋白已被證明可在軟骨變性和形成中發(fā)揮重要作用[15-17]。ZNF440是一種在靈長類動物包括人類、黑猩猩和猴子中發(fā)現(xiàn)的C2H2型蛋白。研究[6]發(fā)現(xiàn),在中重度脊柱小關節(jié)軟骨OA患者中,NF440表達增加,而降低ZNF440的表達水平可引起NF-κB-p65磷酸化下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn),ZNF440在Knee OA組軟骨中的表達顯著高于對照組(非退變)軟骨,這說明OA可導致ZNF440表達上調(diào)。

多種炎癥介質(zhì)在OA發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用,研究[2,18-19]發(fā)現(xiàn),OA期間IL-1β在OA患者的滑膜和軟骨組織中普遍高表達,并可刺激MMP-1,MMP-3和MMP-13的釋放,誘導IL-6、IL-8、MCP-1和CCL5等趨化因子的產(chǎn)生。本研究結果說明ZNF440在OA的發(fā)生發(fā)展過程中軟骨細胞的損傷和退行性作用起到促進作用,其機制可能與ZNF440促進炎癥反應和分解代謝有關。早期研究[20]發(fā)現(xiàn),OA軟骨細胞可發(fā)生形態(tài)學改變,而且凋亡比例高于正常組織,提示骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡是一種可能的OA病理途徑。本研究結果發(fā)現(xiàn),與CTL-GFP轉染的軟骨細胞相比,ZNF440-GFP轉染的Knee OA軟骨細胞中PARP p85蛋白表達和Annex-inV/7-AAD雙陽性細胞量明顯增加。這些結果表明,ZNF440在OA的病理過程中具有促凋亡作用,抑制ZNF440的表達可能有助于延緩OA的發(fā)生發(fā)展。

在OA的病理過程中,IL-1β誘導產(chǎn)生的蛋白酶能夠降解軟骨,是OA發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動因素[21-22],此外,ZNF440的表達在IL-1β刺激下可顯著增加[5]。基于此,本研究通過給予IL-1β刺激膝關節(jié)軟骨細胞建立OA體外模型,結果發(fā)現(xiàn),ZNF440過表達軟骨細胞中MMP13、IL6、MCP1、PARP p85表達和Annex-inV/7-AAD陽性細胞數(shù)量明顯增加,這些效果在IL-1β刺激后表現(xiàn)更明顯。然而,敲除ZNF440可顯著逆轉OA軟骨細胞中IL-1β引起的損傷作用。這些結果說明促炎因子IL-1β在ZNF440表達和功能方面發(fā)揮重要的促進作用。

鑒于ZNF440可能是與OA相關的分解代謝過程調(diào)節(jié)器,本研究利用Connectivity Map篩選化合物,通過qPCR驗證,并確定了Scriptaid可以減少ZNF440在人膝關節(jié)OA軟骨細胞中的表達。Scriptaid是一種廣譜的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi),主要功能是抑制Ⅱ類(a)HDACs[23]。結果發(fā)現(xiàn),用Scriptaid干預可明顯減少ZNF440高表達的人膝關節(jié)OA軟骨細胞中分解代謝和凋亡標志物的表達。有研究[6]發(fā)現(xiàn)ZNF440可部分調(diào)控人類關節(jié)突軟骨細胞中的NF-κB-p65(p-p65)表達,因此,ZNF440可能通過改變p-p65的表達來調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥標志物的表達。與此相一致,Ji等[24]發(fā)現(xiàn),在小鼠軟骨細胞系ATDC5中,IL-1β誘導的細胞凋亡和炎癥標志物的表達上調(diào)可以通過降低p-p65的水平而減弱。然而,ZNF440在促進炎癥和細胞凋亡方面的確切作用需要在未來的研究中進一步闡明。

4 結論

ZNF440在人Knee OA軟骨中表達增加,通過調(diào)節(jié)細胞中炎癥、分解代謝和凋亡標志物的表達參與軟骨退行性機制。小分子化合物Scriptaid可降低ZNF440的表達,并抑制其在OA軟骨細胞中的破壞作用,可能成為臨床治療OA患者的新型藥物。