曹文瓊 黃新梅 高紅梅 朱學(xué)新 馬瀟 賈新燕

(蘭州市第一人民醫(yī)院腎病科,甘肅 蘭州 730050)

近年來(lái),慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的發(fā)病率不斷增加。CKD是一種多因素疾病,糖尿病和高血壓是導(dǎo)致CKD的主要原因,此外,還有一些其他常見(jiàn)原因,包括腎小球腎炎、多囊腎病、腎結(jié)石、尿路感染和腎毒素等[1]。CKD的確切機(jī)制尚不清楚,最終共同途徑涉及腎小球硬化、血管硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。高尿酸血癥是導(dǎo)致腎功能損害的重要因素,研究[2]表明,高尿酸血癥可通過(guò)多種機(jī)制加重CKD患者的腎功能損害,包括直接毒性作用、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、誘導(dǎo)線粒體功能障礙以及氧化應(yīng)激等。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)CKD患者高尿酸血癥的患病率為36.6%～50%[3-4],且隨著CKD的進(jìn)展呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)。

NOD樣受體家族核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3) 屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員,作為固有免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體,可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式以及損傷相關(guān)分子模式?；罨腘LRP3能夠與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和pro-Caspase-1相互作用,形成胞質(zhì)復(fù)合物從而產(chǎn)生具有活性的Caspase-1,并觸發(fā)下游促炎介質(zhì)IL-1β的成熟和釋放,從而參與各種炎癥性疾病[5-6]。已有研究[7]表明,高尿酸血癥腎病患者外周血單核細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的mRNA表達(dá)水平明顯升高,血漿內(nèi)IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18水平也均升高,因此推測(cè)NLRP3/IL-1β信號(hào)通路及其相關(guān)炎癥因子參與了高尿酸所致CKD的腎功能損害。此外,在缺血/再灌注誘導(dǎo)急性腎損傷后引起的CKD 模型小鼠中檢測(cè)到血清、尿液和腎組織中NLRP3表達(dá)均升高,并檢測(cè)到腎組織內(nèi)NLRP3信號(hào)通路相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào),這一現(xiàn)象與腎功能損害程度密切相關(guān)[8]。鑒于上述內(nèi)容,為了驗(yàn)證干預(yù)高尿酸血癥CKD中NLRP3/IL-1β信號(hào)通路能否對(duì)腎功能起到保護(hù)作用,本研究通過(guò)構(gòu)建高尿酸血癥CKD大鼠模型并以NLRP3抑制劑MCC950與IL-1β抑制劑GIBH-130進(jìn)行作用, 觀察該作用下大鼠模型相關(guān)指標(biāo)變化,并初步探討作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重為180～220 g的雄性SD大鼠,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)提供,健康且無(wú)特定病原體,飼養(yǎng)條件設(shè)置為溫度23～25℃,相對(duì)濕度控制在55%～65%,12 h/12 h交替照明,噪音小于60分貝,環(huán)境經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理,環(huán)境清潔、通風(fēng)良好。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 主要試劑 氧嗪酸鉀購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;NLRP3抑制劑MCC950購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司;IL-1β抑制劑GIBH-130和免疫組織化學(xué)染色(DAB顯色)試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司;IL-1β、TNF-α、IL-18 ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物公司;SOD與MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司;HE染色試劑盒和PAS染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物公司;Epon812、醋酸鈾和檸檬鉛購(gòu)于美國(guó)EMS公司;PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒和ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液購(gòu)于上海碧云天生物公司;兔抗人Nephrin、Podocin、NLRP3、IL-1β、Caspase-1、GAPDH多克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG等抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模 參考文獻(xiàn)方法[9]制備高尿酸血癥CKD大鼠模型。將30只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,切除右腎,按照數(shù)字隨機(jī)表法分為模型組、NLRP3抑制劑組、IL-1β抑制劑組,每組10只。術(shù)后1周,3組大鼠均開(kāi)始以800 mg/kg的劑量灌胃氧嗪酸鉀,每日一次,連續(xù)24 d,以構(gòu)建高尿酸血癥CKD模型。同時(shí),NLRP3抑制劑組大鼠以10 mg/kg 的劑量灌胃NLRP3抑制劑MCC950,1次/日,連續(xù)24 d;IL-1β抑制劑組大鼠以0.25 mg/kg的劑量灌胃IL-1β抑制劑GIBH-130,1次/日,連續(xù)24 d;另取10只健康SD大鼠作為對(duì)照組,以等容量蒸餾水灌胃。 實(shí)驗(yàn)期間,所有大鼠均提供普通飼料和蒸餾水以自由飲食飲水。

1.3.2 血清生化指標(biāo) 測(cè)定各組大鼠在最后一次給藥24 h后,通過(guò)眶靜脈采血,室溫靜置2 h后,以3500 rpm/min 離心10 min,收集上清。通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中SUA、BUN和Scr水平,具體根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 腎組織炎癥因子水平檢測(cè) 各組大鼠取血后處死,在無(wú)菌環(huán)境下解剖取左腎組織,剪取約0.5 g腎組織,加入預(yù)冷的PBS緩沖液,研磨制成勻漿,以4000 rpm/min離心10 min,收集上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度,采用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-1β、TNF-α及IL-18水平,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各因子含量。

1.3.4 HE染色 將解剖的各組大鼠左腎組織固定在10%中性福爾馬林液中,24 h后經(jīng)梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)上連續(xù)切成厚度為4 μm的組織薄片。將切片脫蠟至水,置入蘇木精染色5 min,流水沖洗后,再于伊紅染色液中染色3 min,流水再次沖洗,脫水后晾干,透明,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)變化,攝取圖像。

1.3.5 PAS染色 各組大鼠腎組織切片經(jīng)脫蠟至水后,置入阿利新藍(lán)溶液中染色10 min,流水沖洗,利用過(guò)碘酸溶液氧化5 min,再浸入SchiffReagent試劑液中染色10 min,流水沖洗,蘇木素染色液復(fù)染,酸性乙醇分化,氨水返藍(lán),流水沖洗干凈,脫水與透明,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎組織染色情況,攝取圖像。

1.3.6 透射電子顯微鏡 觀察各組大鼠腎組織在2.5%戊二醛中固定,切片機(jī)上將組織切成大小約為1 mm3的組織塊。固定好后,丙酮脫水,Epon812浸透,純包埋液完全包埋,通過(guò)超薄切片機(jī)切成厚度約為1 μm的組織薄片,經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鋁染色后,通過(guò)透射電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,攝取圖像。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色 將固定好的腎組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切片機(jī)切成4 μm 的石蠟組織切片。切片進(jìn)行脫蠟處理,滴加檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù),用3%H2O2室溫處理30 min。滴入山羊血清室溫封閉30 min,然后滴加稀釋的兔抗人Nephrin多克隆抗體(1∶100)和兔抗人Podocin多克隆抗體(1∶100),置于4℃孵育過(guò)夜;次日,PBS 沖洗,滴加對(duì)應(yīng)稀釋的二抗(1∶1000),37℃孵育30 min。PBS沖洗,利用DAB顯色,流水沖洗,在蘇木精溶液中復(fù)染,經(jīng)脫水與透明后,晾干,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察組織內(nèi)著色情況,攝取圖像,胞質(zhì)、胞核染為棕色至棕褐色為陽(yáng)性,隨機(jī)選擇5個(gè)視野,通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行分析,分別計(jì)算Nephrin和Podocin陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.8 Western blot法 將各組大鼠腎組織在無(wú)菌環(huán)境下剪碎,加入預(yù)冷蛋白裂解液裂解,收集上清,BCA法定量檢測(cè)蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品分別與5×Loading buffer混合,制備10% SDS-PAGE凝膠,將蛋白上樣至凝膠孔內(nèi),恒壓電泳分離蛋白質(zhì),并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,將稀釋的兔抗人NLRP3、IL-1β、Caspase-1多克隆抗體(1∶1000)作為一抗,與膜共置于4℃下孵育過(guò)夜;次日,TBST洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5000)作為熱炕,與膜室溫孵育1 h,TBST再次洗膜,ECL試劑液顯影,X射線膠片曝光后定影,Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值,內(nèi)參蛋白為GAPDH,以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為NLRP3、IL-1β以及Caspase-1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.9 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 取各組大鼠左腎組織,無(wú)菌環(huán)境下剪碎并加入裂解液,利用勻漿機(jī)制備勻漿液,以4000 rpm/min離心20 min,收集上清液,檢測(cè)SOD活性與MDA含量,步驟參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清腎功能指標(biāo) 通過(guò)檢測(cè)各組大鼠血清SUA、BUN和Scr來(lái)評(píng)價(jià)腎功能,與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清SUA、BUN和Scr水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠血清SUA、BUN以及Scr水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清SUA、BUN和Scr水平比較Table 1 Comparison of serum SUA, BUN and Scr levels of rats in each group

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較 ELISA檢測(cè)各組大鼠腎組織炎癥因子含量的結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量均顯著升高(P<0.05);而NLRP3抑制劑組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量均顯著低于模型組(P<0.05);IL-1β抑制劑組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量也均顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-18含量比較Table 2 Comparison of IL-1β, TNF-α and IL-18 contents in kidney tissue of rats in each group

2.3 各組大鼠腎組織病變觀察 經(jīng)過(guò)HE染色和PAS染色觀察到,對(duì)照組大鼠腎組織形態(tài)清晰,腎小球、腎小管及腎間質(zhì)均未見(jiàn)明顯病理改變;模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)異常,可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞明顯壞死、萎縮,腎小球系膜增生,系膜細(xì)胞減少,并有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等損傷現(xiàn)象;而相較于模型組,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織病理?yè)p傷均減輕,形態(tài)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)觀察(上HE,100×;下PAS,100×)Figure 1 Histopathological observation of rat kidney in each group

同時(shí),透射電鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,絕大多數(shù)足突排列整齊,貼附于腎小球基底膜外側(cè);模型組大鼠腎小球足細(xì)胞足突增粗,出現(xiàn)融合或消失的現(xiàn)象,且腎小球基底膜增厚;相較于模型組,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠足細(xì)胞足突融合或消失現(xiàn)象得到改善,腎小球基底膜也未見(jiàn)明顯增厚。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腎組織足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化(透射電鏡,20000×)Figure 2 Ultrastructural changes of podocytes in renal tissue of rats in each group 注:紅色箭頭為足突,黃色為基底膜。

2.4 各組大鼠腎組織Nephrin與Podocin表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腎組織內(nèi)可見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色,模型組大鼠腎組織中陽(yáng)性染色較對(duì)照組變淺,Nephrin陽(yáng)性率與Podocin陽(yáng)性率均顯著減少(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織中陽(yáng)性染色均加深,Nephrin陽(yáng)性率與Podocin陽(yáng)性率也均顯示為顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.5 各組大鼠腎組織NLRP3/IL-1β信號(hào)通路蛋白水平比較 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎組織內(nèi)NLRP3、IL-1β及Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組大鼠腎組織內(nèi)NLRP3、IL-1β、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織NLRP3/IL-1β信號(hào)通路蛋白表達(dá)Figure 4 Western blot detection of NLRP3/IL-1β signaling pathway protein expression in kidney tissue of rats in each group注:1.對(duì)照組;2.模型組;3.NLRP3抑制劑組;4.IL-1β抑制劑組。與對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05。

2.6 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 經(jīng)過(guò)檢測(cè)各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎組織SOD活性顯著低于對(duì)照組,而MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);與模型組相比,NLRP3抑制劑組和IL-1β抑制劑組腎組織SOD活性均顯著升高,MDA含量均顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腎組織SOD和MDA水平檢測(cè)Figure 5 Detection of SOD and MDA levels in kidney tissue of rats in each group注:與對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05。

3 討論

高尿酸血癥是高血壓、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、代謝綜合征以及CKD發(fā)生的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。肝臟尿酸生成過(guò)多和腎臟排泄不足均可能導(dǎo)致高尿酸血癥,尿酸是嘌呤分解代謝的最終氧化產(chǎn)物,在人體中其濃度的改變通常與腎臟中尿酸結(jié)晶的形成有關(guān),從而導(dǎo)致尿酸結(jié)石,引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)并引起腎臟損傷[10]。目前,隨著人類生活條件和生活方式的改善,高尿酸血癥腎病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加。針對(duì)高尿酸血癥CKD的治療策略主要集中在使用黃嘌呤氧化還原酶抑制劑減少體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生或者利用促尿酸排泄劑促進(jìn)尿液中尿酸的排泄。然而,這兩種治療劑均由于引起的不良副作用而使得臨床使用受限,例如,別嘌呤醇是常用的黃嘌呤氧化還原酶抑制劑,可損害嘧啶代謝導(dǎo)致部分使用者出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)和粒細(xì)胞缺乏癥,并進(jìn)一步加重了腎毒性和腎損傷[11]。因此,迫切需要尋找有效且毒性小的藥物來(lái)治療高尿酸血癥CKD。

NLRP3炎癥小體由模式識(shí)別受體蛋白NLRP3、包含CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和效應(yīng)蛋白前Caspase-1組成。作為NLR炎性通路中的重要組成部分,可被細(xì)菌、病毒等多種病原體危險(xiǎn)信號(hào)刺激后活化,被激活的NLRP3能夠募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白與前體Caspase-1形成炎癥小體復(fù)合物,并通過(guò)自我切割產(chǎn)生具有活性的Caspase-1;Caspase-1作為IL-1β轉(zhuǎn)化酶,經(jīng)自身催化激活后,可將無(wú)活性的促炎因子IL-1β和前體IL-18的前體剪切加工為成熟的IL-1β和IL-18并釋放出來(lái),進(jìn)一步增加局部炎性相關(guān)基因表達(dá),從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織損傷[6],此外,Caspase-1還能夠啟動(dòng)細(xì)胞死亡程序[12]。研究[13-14]表明,NLRP3/IL-1β信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括自身免疫性疾病、感染和非感染性疾病。同樣,該通路參與腎臟疾病的炎癥反應(yīng),可引起病理性病變和腎臟損傷,在腎臟疾病進(jìn)程中起著重要作用。例如,Zhao等[15]研究表明NLRP3炎癥小體的激活可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體功能障礙來(lái)調(diào)節(jié)Ang II誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,抑制或阻斷NLRP3可明顯減輕線粒體功能障礙引起的腎損傷;Krishnan等[16]研究發(fā)現(xiàn)在高血壓小鼠模型中,使用NLRP3抑制劑MCC950可以顯著降低血壓和腎組織纖維化,抑制腎臟中IL-18和IL-1β的表達(dá),并減輕了腎功能障礙。同樣,本研究表明,經(jīng)NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用的高尿酸血癥CKD大鼠腎組織內(nèi)IL-1β、TNF-α和IL-18含量均下降,這提示腎組織炎癥反應(yīng)減輕。高尿酸血癥加重腎臟負(fù)擔(dān),造成腎臟損害,引起腎臟損害相關(guān)指標(biāo)如Scr 和BUN升高,經(jīng)NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用也明顯降低了血清SU A、BUN和Scr水平,因而改善了腎功能。此外,組織病理學(xué)觀察結(jié)果還表明,NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130治療均明顯減輕了高尿酸血癥CKD大鼠的腎損傷,提高了Nephrin和Podocin的表達(dá)水平。Nephrin是由足細(xì)胞表達(dá)的位于裂孔隔膜上的跨膜蛋白,能夠與Podocin結(jié)合形成復(fù)合體以維持裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)完整,這兩種特異性蛋白是腎小球基底膜的關(guān)鍵成分[17]。以上這些結(jié)果均表明,利用抑制劑靶向抑制NLRP3/IL-1β信號(hào)通路可顯著改善高尿酸血癥CKD大鼠腎功能。

氧化應(yīng)激是在各種因素刺激下機(jī)體活性氧或自由基相對(duì)超負(fù)荷,引起細(xì)胞內(nèi)多種生物大分子發(fā)生損傷,從而對(duì)生命活動(dòng)產(chǎn)生影響的應(yīng)激反應(yīng)。腎臟組織是一個(gè)高度代謝的器官,線粒體中富含氧化反應(yīng),這使得其容易受到氧化應(yīng)激造成的損害[18]。氧化應(yīng)激可以加速腎臟疾病的進(jìn)展,此外,在CKD晚期患者中,氧化應(yīng)激增加與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和貧血等并發(fā)癥有關(guān)[19]。有研究[20]表明,線粒體能夠通過(guò)釋放活性氧促進(jìn)DNA釋放到胞質(zhì)溶液中,激活NLRP3炎癥小體并引起腎臟疾病,可見(jiàn)氧化應(yīng)激在腎臟疾病的發(fā)生中起著重要作用,而通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)NLRP3途徑活化,可達(dá)到改善腎功能的作用[21]。本研究顯示,高尿酸血癥CKD大鼠腎組織SOD活性下降而MDA含量升高,表明組織內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng);在NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑GIBH-130作用下,大鼠腎組織SOD活性升高,同時(shí)MDA含量下降,這提示組織內(nèi)氧化應(yīng)激受到抑制。

4 結(jié)論

NLRP3/IL-1β信號(hào)通路與高尿酸血癥CKD發(fā)生發(fā)展有關(guān),通過(guò)抑制該途徑可阻止腎組織炎癥因子釋放,減輕腎組織損傷,并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而起到對(duì)腎功能的保護(hù)作用。由此推測(cè),NLRP3/IL-1β信號(hào)通路可作為高尿酸血癥CKD治療的潛在靶點(diǎn)。