賈祎佳 陸廷盛 陳啟鸰 楊建文 歐陽北平 楊再松 羅春山

(貴州省骨科醫(yī)院脊柱科,貴州 貴陽 550014)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是脊柱外科最常見的神經系統(tǒng)疾病,致殘率高、破壞性強、恢復性差,極大損害患者自主生活能力,給其心理及家庭造成沉重負擔[1-2]。神經元死亡及形態(tài)結構受損是引發(fā)SCI患者感覺、運動及自主神經功能障礙等的關鍵因素,缺血缺氧誘發(fā)的神經炎癥是導致脊髓神經元形態(tài)損傷及死亡的主要病理機制,減輕神經元炎性損傷是SCI后神經功能修復的有效策略[3-4]。音猬因子(Sonic Hedgehog,Shh)是調控哺乳動物胚胎發(fā)育和器官形成的重要因子,在中樞神經系統(tǒng)損傷后具有神經保護作用,SCI后鞘內注射Shh可通過減輕神經炎癥而促使神經功能恢復[5],骨髓間充質干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)具有潛在的神經保護特性,但直接進行移植存在難以存活、去分化、免疫排斥等風險,而其分泌的外泌體作為一種包含多種微小RNA、蛋白質、核酸等內容物的囊泡狀小體,在細胞分化、存活、凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵作用,BMSCs外泌體及過表達Shh的BMSCs外泌體均可減少神經元凋亡,對SCI具有保護作用,且后者作用更強[6]。miR-133a是組織細胞重要的炎性調節(jié)因子,其家族成員miR-133a-3p可靶向結合核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)阻斷其控制的炎癥信號,減輕對比劑腎病腎組織炎癥損傷[7],過度表達miR-133a-3可減輕脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的小膠質細胞激活,降低促炎細胞因子表達[8],還可減少慢性縮窄性損傷大鼠炎癥因子產生,抑制脊髓神經炎癥,改善大鼠神經病理性疼痛[9],miR-133作為進化上保守的微小RNA,對其進行敲除時Shh表達廣泛下調,激活Shh信號可挽救miR-133敲除導致的胚胎肌生成受損[10],推測miR-133a和Shh之間可能互相調控對方表達,Shh-BMSCs 外泌體可能通過調控miR-133a促使SCI后功能恢復。本文以LPS處理大鼠脊髓神經元構建SCI細胞模型,探討Shh-BMSCs 外泌體調控miR-133a對LPS誘導脊髓神經元細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠脊髓神經元細胞(貨號CP-R144)、大鼠脊髓神經元細胞完全培養(yǎng)基(貨號CM-R144)、大鼠BMSCs(貨號CP-R131)、大鼠BMSCs完全培養(yǎng)基(貨號CM-R131)-武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒(貨號G021-1-2)購自南京建成生物工程研究所有限公司;Shh過表達質粒、miR-133a inhibitor、miR-133a inhibitor陰性對照、miR-133a及U6、Shh、GAPDH引物、(FITC/PI雙染法)Annexin V凋亡檢測試劑盒(貨號E606336-0100)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(D731168)、大鼠白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒(貨號D731007)、大鼠白細胞介素IL-10 ELISA試劑盒(貨號D731011)、一步法反轉錄熒光定量試劑盒(貨號B639277)購自上海生工生物工程股份有限公司;兔源抗大鼠Shh抗體(貨號ab19897)、兔源抗大鼠ASC抗體(貨號ab180799)、兔源抗大鼠caspase-1抗體(貨號ab286125)、兔源抗大鼠GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體(貨號ab18207)、兔源抗大鼠NLRP3一抗(貨號ab263899)購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555(貨號P0179)-購自上海碧云天生物技術有限公司等。全波長酶標儀購自杭州奧盛儀器有限公司-型號FlexA-200;流式細胞儀購自廣州吉源生物科技有限公司-型號CyFlow Cube8;倒置熒光顯微鏡購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司-型號MF-53N;實時熒光定量PCR儀購自美國美谷分子公司-型號ForeQuant F4/F6;基礎電泳電源、小型垂直電泳槽、小型轉印槽均購自廣州道一科學技術有限公司-型號Basic 200、Di PES-5、Di TB-5;化學發(fā)光凝膠成像儀購自森西賽智科技有限公司-型號ChampChemi500等。

1.2 方法

1.2.1 Shh-BMSCs外泌體制備 快速解凍購買的大鼠BMSCs,以其完全培養(yǎng)基于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行復蘇培養(yǎng),取傳到第3代的BMSCs接種在培養(yǎng)皿中,使用脂質體2000并參照其說明書中步驟轉染Shh過表達質粒,24 h后采用可去除外泌體的MEMα完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs,48 h后收集培養(yǎng)基進行超高速離心,分離得到Shh-BMSCs外泌體,將其置于鎳網,于室溫下干燥晾干[11]。

1.2.2 LPS和Shh-BMSCs外泌體最佳作用 濃度篩選快速解凍購買的大鼠脊髓神經元細胞,復蘇培養(yǎng)并傳代后接種在無菌96孔板中,每孔約含有1×104個細胞,培養(yǎng)24 h后分別以0、100、300、500、700、900 μg/mL的LPS處理[12],24 h后采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測各組細胞活力,公式為:細胞活力=(藥物組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%,分析得出IC50值,篩選出LPS最佳作用濃度。以500 μg/mL的LPS處理傳代的大鼠脊髓神經元細胞誘導建立SCI細胞模型,采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測經0、20、40、80、120、160 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理[11]24 h后的各組細胞活力,具體方法與上相同。

1.2.3 細胞分組處理及標本收集 取傳代的大鼠脊髓神經元細胞接種在無菌的24孔板中,于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后隨機分為對照組、模型組、Shh-BMSCs外泌體組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組,對照組不做處理,其余各組以500 μg/mL的LPS處理誘導建立SCI細胞模型,同時Shh-BMSCs外泌體組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理,miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組采用脂質體2000并參照其說明書中步驟分別轉染miR-133a inhibitor及其陰性對照,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理同時轉染miR-133a inhibitor,24 h收集各組細胞及其培養(yǎng)液。

1.2.4 檢測各組細胞凋亡情況 取1.2.3中收集的各組細胞,以PBS清洗后重懸,混勻后計數,每組取約含5×105個細胞的細胞懸液離心,向細胞沉淀中加入Annexin V凋亡檢測試劑盒中染液,避光條件下做FITC/PI雙染處理,然后以PBS再次清洗細胞后通過流式細胞儀測定分析各組細胞凋亡率。

1.2.5 檢測各組細胞軸突長度 取傳代的大鼠脊髓神經元細胞接種在無菌的24孔板中(每孔中含有細胞載玻片),于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后按照1.2.3中方法進行分組處理24 h,以PBS清洗細胞后分別加入5%牛血清白蛋白、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體溶液進行孵育,以PBS漂洗后加入Alexa Fluor 555標記的抗兔二抗孵育做免疫熒光染色,以PBS再次漂洗后,取出各組細胞爬片滴加抗熒光淬滅劑后封片,參照免疫熒光染色試劑盒說明指導于熒光顯微鏡下觀察,神經元呈現紅色,任選3個視野拍照,使用Image J軟件中的Neuron J插件對圖像中軸突長度進行定量分析。

1.2.6 測定各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-10釋放水平 取1.2.3中收集的各組細胞培養(yǎng)液,以1000 r/min的轉速離心5 min,采用ELISA法檢測其中TNF-α、IL-1 β和IL-10水平,具體步驟參照各自ELISA試劑盒說明書中方法進行。

1.2.7 測定各組細胞miR-133a和Shh mRNA表達 取1.2.3中收集的各組細胞,采用Trizol試劑并參照其說明指導提取出各組總RNA,然后采用一步法反轉錄熒光定量試劑盒中試劑分別加入各基因引物及總RNA配制反應體系,配制方法及反應條件設置參照其試劑盒說明書指導進行,miR-133a選用U6做內參,Shh選用GAPDH做內參,實驗所得Ct值采用2-ΔΔCt算法做分析得出miR-133a和Shh mRNA表達,引物序列如下:miR-133a上游引物:5′-CTCGAGCT CAAGTAGGGATCCAGCATTGGTATGATAATT-3′,下游引物:5′-AGCGCTGCTCGAGGCAAGCTTT TATTTGATTATAATCAC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCTGAGAACGGGAAGC-3′,下游引物:5′-CC ATGGTGGTGAAGACGC-3′;Shh上游引物:5′-AA AAGCTGACCCCTTTAGCC-3′,下游引物:5′-GAT GTCGGGGTTGTAATTGC-3′;U6上游引物:5′-GA CACGCAAATTCGTGAAGCG-3′,下游引物:5′-TC CAGTGCAGGGTCCGAG-3′。

1.2.8 檢測各組細胞Shh及NLRP3炎性通路蛋白水平 取1.2.3中收集的各組細胞,采用RIPA裂解液并參照其說明指導提取出各組總蛋白,然后采用改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒測量其濃度,具體方法參照其試劑盒說明書指導進行,根據測量結果每組取20 μg總蛋白沸水浴變性、120V恒壓跑電泳、40mA穩(wěn)流濕轉,獲得按分子量大小分離開的蛋白承載在硝酸纖維膜上,將GAPDH、Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白按照其分子量從膜上裁下,分別孵育3%牛血清白蛋白、均稀釋2000倍的一抗、稀釋1000倍的二抗,封閉后進行抗原抗體反應,滴加化學發(fā)光試劑顯色蛋白條帶,采集其圖像后使用Image J軟件對其灰度進行定量,最后統(tǒng)計后得出各蛋白相對表達。

2 結果

2.1 LPS和Shh-BMSCs外泌體作用濃度確定 不同濃度LPS均可降低脊髓神經元細胞活力(見圖1)。IC50值為(507.76±5.23) μg/mL,選擇接近IC50的500 μg/mL LPS處理脊髓神經元細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度LPS對脊髓神經元細胞活力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of LPS on the activity of spinal cord neurons注:與0 μg/mL LPS相比,①P<0.05。

不同濃度Shh-BMSCs外泌體均可提升LPS誘導脊髓神經元細胞活力,在一定濃度范圍內,隨Shh-BMSCs外泌體濃度升高而作用增強,在濃度為80 μg/mL時,脊髓神經元細胞活力進入平臺期,Shh-BMSCs外泌體對其的提升作用不再增強,因此選擇80 μg/mL Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導脊髓神經元細胞進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 不同濃度Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Shh BMSCs exosomes on the activity of spinal cord neurons induced by LPS注:與0 μg/mL Shh-BMSCs外泌體相比,①P<0.05。

2.2 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經元細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經元細胞凋亡率降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞凋亡率升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經元細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3、表1。

表1 各組脊髓神經元細胞凋亡率和細胞軸突長度Table1 Apoptosis rate andLength of axons of spinal cord neurons in each group

圖3 流式細胞實驗檢測各組脊髓神經元凋亡情況Figure 3 Detection of apoptosis of spinal cord neurons in each group by flow cytometry

2.3 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞軸突長度的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經元細胞軸突長度明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經元細胞軸突長度升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞軸突長度降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經元細胞軸突長度無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞軸突長度降低(P<0.05)。見圖4、表1。

圖4 免疫熒光染色β-tublin Ⅲ檢測各組脊髓神經元細胞軸突(1000×)Figure 4 Immunofluorescence staining β-Tublin Ⅲ to detect axons of spinal cord neurons in each group

2.4 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞炎癥因子TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平明顯升高(均P<0.05),IL-10釋放水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平降低(均P<0.05),IL-10釋放水平升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(均P<0.05),IL-10釋放水平降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經元細胞TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平均無明顯變化(均P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(P<0.05),IL-10釋放水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 脊髓神經元TNF-α、IL-1β和IL-10釋放水平Table 2 TNF-α, IL-1β and IL-10 release levels of spinal cord neurons in each group

2.5 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組脊髓神經元細胞miR-133a和Shh mRNA相對表達Figure 5 Relative expression of miR-133a and Shh mRNA in spinal cord neurons of each group注:與對照組相比,①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05;與Shh-BMSCs外泌體組相比,③P<0.05。

2.6 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導脊髓神經元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經元細胞Shh蛋白表達明顯降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組分別比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經元細胞Shh蛋白表達升高(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經元細胞Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05)。見圖6、表3。

表3 各組脊髓神經元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關蛋白相對表達Table 3 Relative expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group

圖6 免疫印跡實驗檢測各組脊髓神經元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關蛋白表達Figure 6 Expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group detected by Western blot注:A.對照組;B.模型組;C.Shh-BMSCs外泌體組;D.miR-133a inhibitor陰性對照組;E.miR-133a inhibitor陰性對照組;F.Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組。

3 討論

SCI其臨床主要以外科手術、物理治療、藥物治療等為主,還發(fā)展了基因治療、細胞移植治療等新型治療手法,但患者神經功能的恢復并不理想,截至目前還沒有公認有效的治療手段,其最大的障礙在于神經元的死亡和受損形態(tài)難以修復,因而積極探索改善神經元凋亡和形態(tài)功能的策略對于SCI患者神經功能的修復意義重大[13-14]。炎癥是造成SCI后神經元形態(tài)損傷和變性死亡的主要原因[3-4],因此本文以LPS處理大鼠脊髓神經元構建SCI細胞模型,結果顯示,以LPS處理大鼠脊髓神經元細胞,可明顯降低其軸突長度及IL-10釋放水平,升高其凋亡率、TNF-α與IL-1 β釋放水平及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明LPS可誘導神經元促炎因子TNF-α、IL-1 β過量表達釋放,減少抗炎因子IL-10表達釋放,激活NLRP3炎性信號,造成神經元炎癥損傷,導致其軸突受損變短,細胞大量凋亡,揭示SCI細胞模型構建成功。

研究[15]顯示進行抗炎治療可增加SCI后神經元的數量并改善其形態(tài),修復SCI大鼠運動功能,Shh可調控炎癥介導的中樞神經系統(tǒng)損傷過程,Shh可抑制炎癥,顯著減少SCI大鼠神經元凋亡,進而修復SCI后神經功能[5,16]。BMSCs分泌的外泌體可顯著增加SCI模型大鼠脊髓中Shh表達,修復脊髓神經損傷,且BMSCs外泌體過表達Shh時對SCI修復效果更好[6],而在Shh沉默的大鼠中,BMSCs外泌體在SCI修復中基本完全無效[17]。本文研究結果表明,Shh-BMSCs外泌體可上調脊髓神經元中Shh表達,促進抗炎因子表達,減少促炎因子產生,抑制NLRP3炎性信號激活,減輕神經元炎癥損傷,修復神經元軸突形態(tài),緩解LPS誘導的脊髓神經元細胞凋亡,揭示Shh-BMSCs外泌體具有明顯的神經保護作用。

miR-133a作為重要的炎性調節(jié)因子,可通過靶向下調NLRP3表達,抑制其炎性小體生成及其介導的促炎反應和細胞熱下垂,降低炎性因子表達,減輕炎癥性細胞死亡,緩解腎組織、主動脈及心肌炎癥損傷[7,18-19]。研究[10]表明miR-133敲除時Shh表達廣泛下調,激活Shh信號可逆轉敲除miR-133導致的細胞增殖、外基質沉積和上皮化受損,由此可知miR-133a和Shh之間可能對對方表達有互相調控作用,但Shh-BMSCs 外泌體是否可調控miR-133a的表達,進而介導LPS誘導的大鼠脊髓神經元凋亡,目前還不清楚。本研究結果顯示,Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導的大鼠脊髓神經元后,神經元中miR-133a表達升高,以miR-133a inhibitor處理LPS誘導的大鼠脊髓神經元可加重神經元炎性損傷,進一步增強其凋亡,表明miR-133a介導Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導的脊髓神經元細胞凋亡的抑制過程;以Shh-BMSCs外泌體和miR-133a inhibitor聯(lián)合處理LPS誘導的脊髓神經元細胞,相比Shh-BMSCs外泌體單獨處理,可降低神經元細胞軸突長度、IL-10釋放水平、Shh mRNA及蛋白表達,升高其凋亡率及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明下調miR-133a表達可減弱Shh-BMSCs外泌體對NLRP3炎性信號的下調及炎癥反應的抑制,拮抗其對神經元形態(tài)的改善及凋亡的減輕作用,最終逆轉Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導大鼠脊髓神經元的保護作用,揭示Shh-BMSCs 外泌體減輕LPS誘導脊髓神經元細胞凋亡是通過上調miR-133a實現的。

4 結論

Shh-BMSCs外泌體可通過促進miR-133a表達而阻斷NLRP3炎性途徑傳導,進而降低LPS誘導的促炎因子表達釋放,減輕脊髓神經元細胞炎癥,阻止其發(fā)生凋亡,改善其軸突結構損傷,最終起到明顯神經保護作用。實驗結果為SCI后神經元損傷修復提供了新的手法選擇,有利于SCI患者神經功能恢復方法的改進與發(fā)展。