劉 青，汪 泓

（濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，山東 濟(jì)南 250012）

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[1-3]，含揮發(fā)油類、單萜類、三萜類及黃酮類等多種化合物，研究表明[4-8]，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1,2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖等成分在受到高溫、高濕、光照等條件的影響時(shí)，易發(fā)生降解反應(yīng)。

中藥材主要來(lái)源于植物、動(dòng)物及礦物質(zhì)等，其本身常帶有一定微生物，且加工炮制過(guò)程中也會(huì)引入微生物，部分微生物生長(zhǎng)繁殖對(duì)中藥材質(zhì)量有一定影響，甚至危及患者健康和生命安全。因此，對(duì)中藥材出廠前進(jìn)行滅菌處理及控制具有十分重要的意義[9]。在實(shí)際生產(chǎn)中，需根據(jù)目標(biāo)藥材和制劑的特點(diǎn)和內(nèi)含化合物的穩(wěn)定性選擇恰當(dāng)?shù)臏缇绞剑纫_(dá)到滅菌效果又要保證有效成分不受破壞，且采用的滅菌方式應(yīng)經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證。目前，中藥材的滅菌方法主要有干熱滅菌法、濕熱滅菌法、流通蒸汽滅菌法、環(huán)氧乙烷滅菌法、微波滅菌法、60Co-γ射線輻照滅菌等多種方法，部分藥材在滅菌過(guò)程中藥材質(zhì)量存在不同程度改變[10]。

本研究分別采用干熱滅菌、濕熱蒸汽滅菌、流通蒸汽滅菌、紫外滅菌、臭氧滅菌、微波滅菌、60Co-γ射線輻照滅菌法，對(duì)白芍藥材進(jìn)行滅菌處理，考察6種有效成分：沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖的含量變化規(guī)律和滅菌效果，為選擇和提供白芍藥材滅菌工藝及質(zhì)控方法提供參考依據(jù)。

1 儀器和材料

2695型高效液相色譜儀（2996DAD檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司）；LS-50LD型立式蒸汽壓力滅菌器（常州杰博森儀器有限公司）；FW200型萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；臭氧消毒機(jī)（上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；VDM50型真空干燥箱（德國(guó)愛(ài)安姆科技有限公司）；FA2004型電子分析天平（上海衡平儀器儀表有限公司）；KQ-250A型超聲波清洗器（北京科偉永興儀器有限公司）；BXH-130型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；YJ-875 型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

芍藥藥材采自安徽亳州華佗鎮(zhèn)，采收時(shí)間為2019年06月15日，經(jīng)鑒定為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的去皮干燥根。沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201906，供含量測(cè)定用）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：110877-201604，供含量測(cè)定用）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943，供含量測(cè)定用）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（批號(hào)：A25D8H50784，純度≥91.4 %）、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19022310，純度≥98.0 %）、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)P29F7F10218，純度≥99.0 %）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芍藥材滅菌處理

取白芍藥材適量，洗凈，潤(rùn)透，切薄片，干燥，分別按下列方法滅菌處理。

2.1.1 干熱滅菌 取白芍藥材飲片適量，于180 ℃干熱滅菌1 h，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.1.2 濕熱蒸汽滅菌 取白芍藥材飲片適量，在121 ℃下滅菌10 min，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.1.3 流通蒸汽滅菌 取白芍藥材飲片適量，置放流通蒸汽滅菌柜內(nèi)，通入蒸汽，待溫度上升至110 ℃、內(nèi)壓0.1 MPa時(shí)，滅菌30 min，待壓力降為零時(shí)取出，置潔凈室內(nèi)冷卻備用，置入滅菌袋中備用。

2.1.4 紫外滅菌 取白芍藥材飲片適量，紫外燈下照射2 h，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.1.5 臭氧滅菌 取白芍藥材飲片適量，臭氧滅菌樣品濃度為20 g/m3，滅菌60 min，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.1.6 微波滅菌 取白芍藥材飲片適量，頻率2500 MHz，滅菌6 min，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.1.760Co-γ射線輻照滅菌 取白芍藥材飲片適量，調(diào)節(jié)輻照劑量為5 kGy，60Co-γ射線輻照滅菌1 h，置潔凈室內(nèi)冷卻至室溫，置入滅菌袋中備用。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品各適量，加甲醇制成含上述成分濃度分別為0.051，0.056，1.550，0.058，0.214和0.126 mg/ml的混合對(duì)照品貯備液；精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取未滅菌及按2.1項(xiàng)下滅菌處理后的白芍飲片各適量，粉碎，取藥材粗粉約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇60 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz) 60 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件[11]

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5 %→8 % A；10～20 min，8 % A→35 % A；20～30 min，35 % A；30～45 min，35 % A→55 % A；45～65 min，55 % A；65～70 min，55 % A→5 % A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

圖1 白芍高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品貯備液，分別精密取0.2，0.4，0.8，1.2，2.4，3.6，4.8 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以峰面積（Y）對(duì)6種成分質(zhì)量濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性范圍方程及r值，線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，測(cè)得沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖峰面積RSD分別為0.20 %，0.18 %，0.04 %，0.14 %，0.32%和0.45 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取未滅菌白芍飲片6份，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算各成分含量和RSD。結(jié)果沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖平均含量分別為1.665，1.453，35.625，1.230，6.145，3.806 mg/g，RSD分別為0.56 %，0.68 %，0.45 %，0.78 %，1.02 %和1.35 %（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取未滅菌白芍飲片，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)色譜條件測(cè)定，分別于0，3，6，9，12，18，24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖峰面積RSD分別為0.86 %，0.75 %，0.58 %，0.95 %，1.32 %和1.55 %（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取未滅菌的白芍飲片6份，粉碎，精密稱取粗粉0.15 g，置具塞錐形瓶中，加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液3.5 ml，加稀乙醇60 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，在2.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算白芍藥材中6種成分加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白芍藥材6種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.6 樣品測(cè)定 取未滅菌、干熱滅菌、濕熱蒸汽滅菌、流通蒸汽滅菌、紫外滅菌、臭氧滅菌、微波滅菌、60Co-γ射線輻照滅菌處理的白芍飲片適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算白芍藥材中6種成分的含量，并繪制各成分在不同滅菌方式下含量變化折線趨勢(shì)圖，含量數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表3、含量變化趨勢(shì)圖見(jiàn)圖2。

表3 白芍藥材中6種成分含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1（n=3）

圖2 不同滅菌方式對(duì)白芍藥材有效成分含量影響趨勢(shì)圖

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

利用DAD檢測(cè)器功能，對(duì)供試品色譜圖中沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖的色譜圖進(jìn)行光譜解析，各成分光譜最大吸收位置存在差異，但在230 nm處吸收值均較強(qiáng)，所以設(shè)定230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究先后考察乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液、甲醇-0.05 %磷酸水溶液和乙腈-0.05 %磷酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.05 %磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，6個(gè)主成分色譜峰分離度、對(duì)稱性更好，所以選取此系統(tǒng)為流動(dòng)相。在以上色譜條件下，分別考察Agilent Zorbax SB-C18、Inertsil?ODS-2、Phenomenex Kinetex C18及Agilent ZORBAX SB-Aq C184種品牌色譜柱，結(jié)果以Agilent ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離效果最佳。

3.2 提取方式的優(yōu)化

為考察白芍藥材最佳提取條件，在查閱文獻(xiàn)[12-14]及單因素試驗(yàn)條件下，本研究以A-料液比、B-乙醇濃度、C-提取時(shí)間為考察因素，6種成分含量數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)白芍藥材提取條件進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)與方差分析結(jié)果見(jiàn)表4～5。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表5 影響白芍藥材有效成分提取因素方差分析表

由表4可見(jiàn)，A3B2C2為最佳提取條件，方差分析結(jié)果表明，藥材粉末料液比（A）對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)有顯著性影響（P＜0.05），是影響藥材中6種成分溶出的主要影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)合環(huán)保、經(jīng)濟(jì)等實(shí)際情況，綜合得出本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)提取條件為：以200倍稀乙醇超聲提取60 min，在此條件下，取3批未滅菌的藥材進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得各成分含量值較高，3批含量偏差均小于0.5，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化條件準(zhǔn)確、試驗(yàn)和可靠，可作為本研究的提取條件。

3.3 滅菌效果檢查

取未滅菌、干熱滅菌、濕熱蒸汽滅菌、流通蒸汽滅菌、紫外滅菌、臭氧滅菌、微波滅菌、60Co-γ射線輻照滅菌處理的白芍飲片適量，按中國(guó)藥典2020年版四部（1105）非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度微生物計(jì)數(shù)法檢查[15]，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，不同的滅菌方式處理后的樣品均符合中國(guó)藥典要求（即需氧菌不得過(guò)105cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不多過(guò)103cfu/g），與其它滅菌方式比較，紫外滅菌和臭氧滅菌較效果較差，濕熱滅菌和輻照滅菌效果最好。

表6 白芍藥材微生物限度檢查結(jié)果

3.4 不同滅菌方式對(duì)白芍質(zhì)量影響

由表2和圖2可見(jiàn)，不同的滅菌方式對(duì)白芍藥材中6種成分含量均有不同程度影響。其中，干熱滅菌對(duì)兒茶素和沒(méi)食子酸的影響最大，可能此二種成分受高溫易降解；其次，臭氧滅菌對(duì)芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷及1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖也有較大影響，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]結(jié)果相符，上述成分在高溫、高濕條件下易降解；7種滅菌方式中，對(duì)含量影響較小為微波滅菌和輻照滅菌。其中，輻照滅菌對(duì)白芍藥材有效成分的影響可忽略不計(jì)，與未滅菌含量數(shù)據(jù)比較，輻照滅菌處理后藥材中芍藥苷、兒茶素、沒(méi)食子酸、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量偏差分別為：0.01 %，0.17 %，0.03 %，0.20 %，0.01 %，0.08 %，所以60Co-γ射線輻照滅菌可作為白芍藥材出廠前的有效滅菌處理方式。

通過(guò)對(duì)干熱滅菌、濕熱蒸汽滅菌、流通蒸汽滅菌、紫外滅菌、臭氧滅菌、微波滅菌、60Co-γ射線輻照滅菌等7種方式對(duì)白芍藥材中6種成分的影響及微生物限度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)白芍藥材最為理想滅菌方式為60Co-γ射線輻照滅菌，此條件下，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、1, 2, 3, 4, 6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖含量穩(wěn)定，滅菌后微生物存活率最低，可保證藥材在流動(dòng)和使用環(huán)節(jié)的微生物限度在許可范圍內(nèi)，可作為白芍藥材的一種有效滅菌手段加以推廣和應(yīng)用。