馬 莉 ，魏 娟，付 宇

（1. 十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院） 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2. 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000；3. 十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院），湖北 十堰 442000）

柴胡為傘形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或狹葉柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）的干燥根[1]。柴胡具有和表解里、升發(fā)清陽、疏肝解郁的作用，臨床使用較普遍，為治療少陽證的最佳要藥[2]。野生柴胡品種多，生長在中國的柴胡品種共有42類，有17個變種、7種形態(tài)[3]。柴胡主要產(chǎn)地是遼寧、河北、山西、河南、甘肅等地；常用于治療寒熱、瘧疾、肝郁氣滯、胸悶肋痛、脫肛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂和直腸前突等疾病[4]。

皂苷類物質(zhì)是柴胡臨床應(yīng)用時最主要的化學(xué)成分[5]，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 含量較高，活性較強[6]?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作為柴胡中藥材的質(zhì)量評價指標。中藥有多成分、多靶點等特點，單一的成分很難全面反映柴胡藥材質(zhì)量，采用多個活性成分進行質(zhì)量評價更加科學(xué)和全面。有研究表明，柴胡中藥材中柴胡皂苷c的含量也較高[7]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷c有抗乙型肝炎病毒（HBV）、抗阿爾茨海默病、抗炎等作用[8-10]，因此將其作為柴胡的指標性成分進行研究，補充完善藥典中柴胡藥材的質(zhì)量評價指標。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AcquityH CLASS超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CP214電子分析天平（奧豪斯）；H1650-W微量臺式高速離心機（湖南湘儀）；2013QT超聲波清洗器（北京碳氫）。

1.2 試藥

柴胡皂苷a，c，d對照品（批號：wkp2020020703，wkp2020042905，wkp2020021001，純度≥98 %，四川維克奇）；柴胡藥材（批號：20190301， 20190302，20190303，產(chǎn)地湖北，湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司），經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院張曉燕教授鑒定為正品；乙腈為色譜純，甲醇、濃氨試液為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫：0～18 min，25 %～90 %A；18～20 min ，90 %～90 %A；柱溫30 ℃；流速0.3 ml/min；于200 nm波長下測定柴胡皂苷a，c，d的含量，進樣量：5 μl。

2.2 供試品溶液的制備

將柴胡藥材粉碎，過四號藥篩，取樣品細粉約0.5 g，精確稱量，置入于具塞錐形瓶，精確加入含5 %濃氨試液的甲醇25 ml ，密塞瓶口，30 min超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz，水溫30 ℃），過濾后分兩次加入20 ml甲醇，洗滌藥品殘渣和容器，合并濾液和洗滌液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，60 ℃加熱溶劑回收至干后，甲醇溶液溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶，定容，搖勻，再次過濾，取濾液[1]。

2.3 混合對照品溶液的制備

取柴胡皂苷a，c，d對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成混合對照品溶液，使每1 ml含柴胡皂苷a，c，d分別為1.3，1.3，1.46 mg，搖勻，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液進樣分析，得樣品的UPLC色譜圖。參照3個對照品的色譜行為及其PAD紫外檢測光譜圖，標定了3個成分，分別是柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d（見圖2）。

圖1 UPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 取2.3項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進樣0.5，2，3.5，5，6.5 μl，以柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的進樣量X（μg）為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，各成分回歸方程見表2。結(jié)果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d分別在進樣量為0.65～8.45，0.65～8.45，0.73～9.49 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 3種成分線性關(guān)系考察試驗數(shù)據(jù)

2.4.3 精密度試驗 精密吸取2.3項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果表明，柴胡皂苷a，c，d峰面積的RSD分別為0.33 %，0.46 %和1.29 %，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果表明，柴胡皂苷a，c，d峰面積的RSD分別為1.66 %，0.85 %和1.42 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一批藥材粉末，按2.2方法項制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件測定含量，得柴胡皂苷a，c，d的平均含量為3.08，1.37，2.53 mg/ml，RSD值分別為1.31 %，2.17 %和2.58 %，表明此法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一批柴胡樣品6份，已知樣品中柴胡皂苷a，c，d的含量，分別精密混合對照品溶液1 ml，按2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣，結(jié)果見表3。

表3 柴胡中3種成分的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.5 樣品含量測定

精密稱取3批柴胡樣品，按2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣測定3種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 3種成分含量測定結(jié)果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 提取方式的選擇

柴胡皂苷對熱不穩(wěn)定[6]，因此采用30 ℃溫水超聲提取?？疾? %氨水甲醇、100 %甲醇和100 %乙腈等不同提取溶劑，結(jié)果表明，5 %氨水甲醇提取效果較好，因此采用5 %氨水甲醇溶液為提取溶劑。

3.2 波長的選擇

用PDA檢測器對樣品于190～400 nm進行全波長掃描，結(jié)果表明，柴胡皂苷a，c，d在200 nm波長下能同時出現(xiàn)且有最大吸收，故選擇于200 nm波長同時測定3種成分的含量。

3.3 流動相的選擇

依次考察了乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸為流動相時色譜峰的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-水為流動相時色譜峰的分離度及峰形較好，且所測成分含量相對較高，這也與文獻報道的柴胡皂苷a、d在酸性條件下易開環(huán)分解相符[11]，故最終選擇乙腈-水進行梯度洗脫。

3.4 UPLC與HPLC色譜法對比

有研究采用HPLC測定3種柴胡皂苷的含量，檢測時間較長，進行1次進樣分析通常需30～60 min，且流動相消耗量較大[12-13]。本研究采用UPLC可在20 min內(nèi)可完成1 次色譜分析，且有更好的分離度、靈敏度和更快的分離速度，單位時間內(nèi)能提供更多的信息量，同時更節(jié)省流動相。

本研究采用UPLC法同時測定柴胡中藥材中3種活性成分的含量，避免了單一活性成分測定帶來的繁瑣步驟，減少了流動相配制和供試品制備步驟，有效提高了分析速度，縮短分析周期。此法簡便、快捷、準確，可為柴胡中藥材的質(zhì)量評價提供參考。