陳 超，張 雯，渠廣民，封 靜 ，趙愛麗 ，陳修毅，李大偉,

（1. 山東省藥學科學院 山東省化學藥物緩釋制劑工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2. 山東省藥學科學院 國家藥監(jiān)局藥物制劑技術研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101；3. 山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

伴隨高通量篩選、組合化學和藥物分子輔助設計等新技術的發(fā)展，大量具有藥物活性的新化合物被篩選發(fā)現(xiàn)。其中，約有40 %新開發(fā)的化合物有難溶性問題[1]。脂質納米粒、納米膠束、環(huán)糊精包合技術是常見的提升藥物溶解性的方法。但這些技術往往需要借助納米載體，因此，載藥量通常不高。而納米晶技術（nanocrystal technology）無需借助載體，可將藥物顆粒尺度處理至亞微米級（100～1000 nm）甚至毫微米級（1～100 nm）[2-3]。作為提升難溶性藥物溶解度的一種藥物制劑新技術，納米晶技術可分為3類：top-down，bottom-up和此兩種方法的聯(lián)合應用。介質研磨作為經典的topdown納米晶制備技術，具有工藝重現(xiàn)性好、易于產業(yè)化等優(yōu)點，是應用最廣泛的納米晶制備技術之一。介質研磨分為干法研磨和濕法研磨兩種，工業(yè)上主要采用濕法介質研磨。濕法介質研磨[4-5]制備的藥物納米晶體粒徑尺度小，比表面積大，可改善溶解度和溶出速率，同時其表面黏附性更大，與生物膜黏附作用時間長，有利于提高生物利用度。與傳統(tǒng)的需借助載體遞送的納米技術相比，納米晶體藥物自身即為遞送體，無需添加增溶作用的大量表面活性劑和載體輔料，有更高的安全性和載藥量，適用于生物藥物分類系統(tǒng)（BCS）中的Ⅱ和IV類藥物，特別是對高劑量難溶性藥物的成藥性開發(fā)有極大幫助[6-7]。

他克莫司（tacrolimus，又稱 FK506）是tsukubaensis鏈菌屬來源的強效大環(huán)內酯類免疫抑制劑，通過與細胞內蛋白FKBP-12 結合形成復合物，抑制鈣調神經磷酸激酶活性，降低白介素-2的轉錄水平，抑制T淋巴細胞活化，發(fā)揮免疫抑制作用[8]。FK506可用于多種免疫介導的眼病治療，單獨或與激素聯(lián)用治療一些難治的眼表炎癥性疾病，如Stevens-Johnson綜合征、眼瘢痕性類天皰瘡、鞏膜炎等[9]。但FK506幾乎不溶于水，不易透過角膜等眼組織產生有效的藥物濃度，因此生物利用度較低。由于眼部生物溶媒較少，改善FK506的溶解度對其眼部給藥至關重要。

本實驗以FK506為模型藥物，采用濕法介質研磨工藝制備FK506納米混懸液，探討該工藝制備的可行性，為開發(fā)高溶解度和療效的FK506制劑提供研究基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PM100實驗室行星式球磨儀（德國弗爾德萊馳），氧化鋯球介質（直徑： 0.1～0.9 mm，萍鄉(xiāng)銳孚）；Zetasizer Nano ZS90納米粒度儀（英國馬爾文）；JY10002型電子天平（上海舜宇恒平）；超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器）。

1.2 試藥

他克莫司（福建科瑞藥業(yè)）；泊洛沙姆188（藥用級，德國BASF）；水（自制）。

2 方法與結果

2.1 藥物FK506納米混懸液的制備

稱取適量泊洛沙姆188加入純水中溶解混合。稱取適量FK506原料加至上述溶液中，超聲5 min，待藥物充分潤濕分散后，將混懸液置入100 ml研磨罐，緩慢加入一定量的氧化鋯球研磨介質。安裝研磨罐，設定球磨儀研磨轉速和研磨時間并運行。待設定研磨參數(shù)運行結束后過濾研磨溶液除去研磨介質，即得FK506納米混懸液。

2.2 納米晶混懸液粒徑評價指標

按照動態(tài)光散射法測定所制備納米混懸液樣品中藥物晶體粒徑。取適量納米混懸液樣品，純水稀釋至適宜濃度，采用馬爾文納米粒徑儀測定藥物晶體的平均粒徑（Z-Ave）及多分散度指數(shù)（PDI），設定介質系數(shù)1.333，測定溫度為25 ℃，平行測定3次，取其平均值。

2.3 納米晶混懸液制備工藝參數(shù)篩選研究

運用單因素試驗設計，以Z-Ave和PDI為評價指標，分別考察研磨轉速、研磨時間、藥物濃度、穩(wěn)定劑用量、研磨介質規(guī)格對藥物晶體粒徑的影響，篩選較優(yōu)納米晶制備工藝參數(shù)。

2.3.1 研磨轉速考察 固定研磨時間為3 h，藥物濃度為1 %，穩(wěn)定劑泊洛沙姆188用量為1 %，研磨介質規(guī)格為0.5 mm，考察濕法介質研磨轉速，分別采用400，500，600 r/min研磨轉速制備納米混懸液。所得納米混懸液藥物晶體Z-Ave和PDI，結果見圖1。由圖1可見，F(xiàn)K506的Z-Ave隨研磨轉速增加，呈減小趨勢。在轉速500和600 r/min時，粒徑雖略有減小，但無顯著變化。高轉速機械運動下，藥物顆粒之間、研磨介質與藥物顆粒之間碰撞更劇烈，產熱現(xiàn)象嚴重，混懸液溫度過高，對于藥物粒徑穩(wěn)定性產生不利影響，且高速運轉加速損耗了球磨設備的使用壽命。因此，優(yōu)選研磨轉速為500 r/min。

圖1 不同研磨轉速制備納米混懸液Z-Ave和PDI測定結果

2.3.2 研磨時間考察 固定研磨轉速500 r/min，藥物濃度1 %，穩(wěn)定劑泊洛沙姆188用量1 %，采用規(guī)格0.5 mm研磨介質，分別于研磨60，120，180，240 min取樣，測定混懸液中藥物Z-Ave和PDI，結果見圖2。由圖2可見，在一定研磨時間（180 min）內，藥物Z-Ave隨研磨時間增加，呈減小趨勢，且與研磨時間呈正相關，藥物粒徑從微米級逐漸減小至納米級別。繼續(xù)延長研磨時間，藥物Z-Ave反而增加，原因可能是長時間研磨增大能量輸入，使小粒徑顆粒聚集增長以維持穩(wěn)定。研磨時間并非越長越好，優(yōu)選研磨時間為180 min。

圖2 不同研磨時間制備納米混懸液Z-Ave和PDI測定結果

2.3.3 穩(wěn)定劑用量的考察 固定研磨轉速500 r/min，研磨時間為3 h，藥物濃度1 %，研磨介質規(guī)格0.5 mm，選取泊洛沙姆188為穩(wěn)定劑，分別配制泊洛沙姆188：FK506濃度處方比例為1:2，1:1，2:1的混懸液，即泊洛沙姆188濃度分別為0.5 %，1 %，2 %，考察不同穩(wěn)定劑用量（以泊洛沙姆188:FK506比例計）對混懸液粒徑的影響。測定納米混懸液中藥物晶體Z-Ave和PdI，結果見圖3。由圖3可見，固定其它研磨工藝參數(shù)，不同穩(wěn)定劑用量下，藥物Z-Ave隨穩(wěn)定劑用量的增加而增加，但增加幅度較小，差異無顯著性。隨穩(wěn)定劑用量增加，混懸液PDI值呈現(xiàn)先增后減的趨勢，結果表明，低用量泊洛沙姆188下，混懸液中納米晶粒徑分布相對更窄，研磨效果更優(yōu)。泊洛沙姆188在研磨過程中易產生泡沫，用量越大，產生泡沫量越大，對后續(xù)過濾操作有不利影響。因此，優(yōu)選穩(wěn)定劑泊洛沙姆188:FK506濃度處方比例為1:2。

圖3 不同穩(wěn)定劑用量（泊洛沙姆188:FK506）混懸液Z-Ave和PDI測定結果

2.3.4 藥物濃度考察 固定研磨轉速500 r/min，研磨時間為3 h，穩(wěn)定劑用量泊洛沙姆188:FK506為1:2，研磨介質規(guī)格0.5 mm，分別配制藥物濃度為0.2 %，1 %和5 %的混懸液進行制備考察，研磨結束測定混懸液中藥物Z-Ave和PDI，結果見圖4。由圖4可見，隨藥物濃度增加，混懸液中藥物Z-Ave先減小后增加。藥物濃度較小時，研磨效率較低，粒徑較大。藥物濃度過高，藥物顆粒間碰撞增加，小粒徑顆粒聚集增長。因此優(yōu)選研磨混懸液藥物濃度為1 %。

圖4 不同藥物濃度混懸液Z-Ave和PDI測定結果

2.3.5 研磨介質規(guī)格考察 固定研磨轉速500 r/min，研磨時間為3 h，穩(wěn)定劑用量泊洛沙姆188:FK506為1:2，藥物濃度1 %，以氧化鋯球為研磨介質，分別選用規(guī)格為0.1，0.3，0.5和0.9 mm的研磨介質制備納米混懸液。測定混懸液中藥物晶體Z-Ave和PDI，結果見圖5。由圖5可見，隨研磨介質規(guī)格增大，藥物Z-Ave變化趨勢呈先減小后增加。研磨介質規(guī)格越小，可研磨接觸的比表面積越大，研磨效率越高，得到的顆粒粒徑越小。但同時在相同介質用量下，研磨介質規(guī)格越小，研磨介質間、研磨介質與研磨腔室間碰撞也增加，研磨能量損耗亦增加，研磨效率降低，介質磨損和剝落風險也增加。因此優(yōu)選研磨介質規(guī)格為0.3 mm。

圖5 不同研磨介質規(guī)格制備混懸液Z-Ave和PDI測定結果

2.4 納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)重復性試驗驗證

根據(jù)單因素試驗結果，F(xiàn)K506納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)為：研磨轉速500 r/min、研磨時間180 min、藥物濃度1 %、穩(wěn)定劑泊洛沙姆188濃度0.5 %、研磨介質規(guī)格0.3 mm。采用以上優(yōu)選制備工藝參數(shù)進行3批試驗驗證重復性，Z-Ave和PDI測定結果見表1。不同批間混懸液中藥物晶體Z-Ave為464.6±21.71 nm，PDI為0.252±0.01。

表1 納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)驗證試驗結果

2.5 納米混懸液放置穩(wěn)定性考察

將采用優(yōu)選工藝參數(shù)所制備的納米混懸液于常溫下放置30 d，分別于1，3，5，10，30 d測定Z-Ave，考察藥物晶體粒徑在室溫條件下放置過程中的粒徑變化，為后續(xù)處方工藝的執(zhí)行和改進提供數(shù)據(jù)基礎。納米混懸液放置穩(wěn)定性試考察結果見表2。

表2 納米混懸液室溫放置穩(wěn)定性考察結果

由表2可見，該工藝制備的納米混懸液室溫放置30天，Z-Ave無顯著增長，混懸液PDI較零時有所增長。納米混懸液作為熱力學不穩(wěn)定體系，納米晶顆粒在放置過程中易發(fā)生顆粒聚集和團聚形成大顆粒或沉積結塊。混懸液PDI增長，表明在放置過程中混懸液粒度分布變寬，提示混懸液中大顆粒晶體增加的風險增加，需進一步優(yōu)化混懸液處方工藝，獲得更好的穩(wěn)定性。

3 討論

濕法介質研磨工藝作為商業(yè)化應用較廣泛的納米晶制備技術，利用研磨介質、藥物顆粒、研磨腔室壁在高速離心運動下相互碰撞摩擦，對藥物顆粒進行高能量剪切破碎。因此研磨轉速、研磨介質、藥物顆粒濃度等對最終形成的藥物納米顆粒有重要影響。一般來說，研磨轉速越高，研磨腔室內物料運動越快，研磨介質、藥物顆粒及研磨腔室壁的碰撞頻率越高，研磨效率及效果越好。研磨介質的球徑越小，比表面積越大，相比同等質量的大球徑研磨介質，物料間可接觸的面積越多，研磨過程中碰撞機率越高，研磨效率及研磨效果也較佳。同理，藥物濃度越高，可碰撞的粒子及接觸面積也增加，但在過高的藥物濃度下，藥物顆粒之間接觸的機率也增加，可能會引起易破碎小粒子的聚集增長，不利于納米晶的制備。同時過高的研磨轉速長時間研磨帶來的發(fā)熱影響不利于納米混懸液的穩(wěn)定。因此通常添加適宜的穩(wěn)定劑以最大限度的維持納米混懸液的穩(wěn)定性。根據(jù)Freundlich-Ostwald 方程[10]，納米混懸液作為熱力學不穩(wěn)定體系，隨著放置時間延長，混懸液中藥物顆粒易發(fā)生Ostwald熟化，導致藥物顆粒的加速沉降，混懸液穩(wěn)定性變差。因此在制備過程中添加適量的穩(wěn)定劑是保持納米混懸液穩(wěn)定的有效措施。本研究選用非離子表面活性劑泊洛沙姆188作為穩(wěn)定劑，可有效潤濕藥物顆粒表面，吸附在藥物顆粒表面，發(fā)揮立體空間阻隔作用，提升體系的穩(wěn)定性。但當穩(wěn)定劑用量過多時會促進藥物顆粒間的橋接作用，反而導致Ostwald熟化發(fā)生。

本研究探索了濕法介質研磨工藝制備難溶性藥物他克莫司納米混懸液的可行性。結果表明，濕法介質研磨工藝制備納米混懸液，設備簡單易得，制備過程簡便易操作，所得產品粒徑分布窄，工藝重現(xiàn)性良好。