張 蕾 ，楊春靜 ，黃明月

（1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100038；2. 臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評價北京市重點實驗室，北京 100038）

芪連降糖片處方來源于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、清華大學(xué)玉泉醫(yī)院全國百名杰出青年中醫(yī)、首都中青年名中醫(yī)馮興中教授的臨床經(jīng)驗方[1-2]，具有益氣補中，清熱解饑之功效。方中黃芪味甘性微溫，具有補益中氣之功效，為君藥；黃連味苦性寒，具有清熱燥濕之功效，為臣藥；兩藥合用，補氣為主，清熱為輔。用于中氣虛弱，濕熱內(nèi)生所致的消渴病，癥見短氣懶言，疲勞乏力，口渴喜飲，消谷善饑，舌紅苔膩，脈細數(shù)。輕、中型2型糖尿病見上述癥狀者。

芪連降糖片為薄膜衣片，是在上述臨床經(jīng)驗方基礎(chǔ)上開發(fā)的中藥1.1類新藥。為有效控制芪連降糖片的質(zhì)量，保證臨床用藥安全穩(wěn)定，本實驗采用薄層色譜法對制劑中黃芪、黃連（味連）進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定了制劑中黃芪甲苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量，建立了穩(wěn)定可靠、專屬性強、重現(xiàn)性好的質(zhì)量控制方法。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（四元梯度洗脫泵，自動進樣器，ELSD檢測器，DAD檢測器，安捷倫），Agilent OpenLAB CDS EZChrom色譜工作站（安捷倫）；phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，廣州菲羅門）；十萬分之一電子分析天平（BT125D，賽多利斯），萬分之一電子分析天平（ME204E/02，梅特勒-托利多）；Milli-Q Intergral 水純化系統(tǒng)（Q-POD，默克）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-600DE，昆山市超聲儀器）；ZF-7紫外檢測燈（上海碩光）；硅膠G薄層板（煙臺江友）。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717，含量96.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；表小檗堿對照品（批號：MUST-18072402，含量98.9 %，成都曼斯特）；鹽酸黃連堿對照品（批號：112026-201601，含量95.1 %，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸巴馬汀對照品（批號：110732-201812，含量97.6 %，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814，含量86.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；黃芪對照藥材（批號：120974-201612，中國食品藥品檢定研究院）；黃連對照藥材（批號：121752-201801，中國食品藥品檢定研究院）。芪連降糖片（批號：20190401，20190402，20190403，每片重0.56 g，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院）；黃芪、黃連（味連）的陰性樣品均為自制。乙腈（批號：191613，色譜純，賽默飛世爾科技）；十二烷基硫酸鈉（批號：STBG9926，色譜純，Sigma-Aldrich公司）；磷酸二氫鉀（批號：C9920060，色譜純，上海安譜）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪的薄層色譜鑒別 取芪連降糖片樣品5片，除去包衣后研細，置入圓底燒瓶。加甲醇20 ml，加熱回流提取1 h，濾過，放冷后濾液在中性氧化鋁柱（100～120目，5 g，內(nèi)徑為10～15 mm）上用100 ml 40 %甲醇洗脫。洗脫液蒸干后加水30 ml將殘渣溶解，并用水飽和的正丁醇萃取2次（每次用量20 ml），將正丁醇萃取液混合后再分別用20 ml水洗滌2次，棄去水液后將正丁醇液在水浴上蒸干。加甲醇0.5 ml溶解所得殘渣，作為供試品溶液；取黃芪陰性樣品粉末0.6 g，采用同樣方法制成黃芪陰性樣品溶液；精確稱量黃芪甲苷對照品0.62 mg，加l ml甲醇使其溶解，作為對照品溶液。參照2020年版《中國藥典》第四部薄層色譜法（通則0502）[3]試驗，吸取上述供試品溶液（批號：20190401，20190402，20190403）、陰性樣品溶液和對照品溶液各2 μl，在同一硅膠G薄層板上分別點樣，按照13:7:2的比例將三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液為展開劑展開，取出晾干后噴以10 %體積分數(shù)的硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至各斑點顯色清晰。結(jié)果顯示在相應(yīng)的位置上，供試品色譜與對照品色譜日光下顯相同的棕褐色斑點；紫外光（波長365 nm）下顯相同的橙黃色至棕褐色熒光斑點，而陰性樣品則在相應(yīng)位置處未見斑點。見圖1-A，B。

圖1 芪連降糖片中黃芪的薄層色譜圖

取芪連降糖片樣品5片，除去包衣后研細，置圓底燒瓶中加乙醇30 ml，加熱回流提取20 min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加0.3 % 氫氧化鈉溶液15 ml溶解并濾過。使用稀鹽酸將過濾液pH值調(diào)節(jié)至5～6，再取乙酸乙酯15 ml萃取。將乙酸乙酯萃取液用鋪有無水硫酸鈉的濾紙濾過，并濃縮干燥。所得殘渣加入l ml乙酸乙酯使其完全溶解，作為供試品溶液；取黃芪陰性樣品粉末0.4 g制得黃芪陰性樣品溶液，制備方法同上；取黃芪對照藥材1.5 g，按照上述方法制成對照藥材溶液。參照2020年版《中國藥典》第四部薄層色譜法（通則0502）[3]試驗，吸取上述供試品溶液（批號：20190401，20190402，20190403）、陰性樣品溶液和對照藥材溶液各10 μl，在同一硅膠G薄層板上分別點樣后利用展開劑（三氯甲烷-甲醇，10: 1）展開，取出室溫晾干，采用氨蒸氣熏蒸后，置紫外光（波長365 nm）下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，而陰性樣品則在相應(yīng)位置處未見斑點。詳見圖1-C。

2.1.2 黃連的薄層色譜鑒別 取芪連降糖片樣品2片，除去包衣后研細，置具塞錐形瓶中加甲醇25 ml，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液；另取黃連對照藥材0.14 g，按照同樣方法制成對照藥材溶液；同法，取黃連陰性樣品粉末0.45 g制得黃連陰性樣品溶液；精確稱取鹽酸小檗堿對照品0.89 mg，加甲醇l ml使溶解，作為對照品溶液。參照2020年版《中國藥典》第四部薄層色譜法（通則0502）[3]試驗，吸取上述供試品溶液（批號：20190401，20190402，20190403）、對照藥材溶液、陰性樣品溶液和對照品溶液各2 μl，在同一硅膠G薄層板上分別點樣，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）為展開劑，在濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開缸內(nèi)展開，取出室溫晾干，置紫外光（波長365 nm）下觀察。結(jié)果表明，供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯5個相同顏色的熒光斑點；在對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點，而陰性樣品則在相應(yīng)位置處未見斑點。見圖2。

圖2 芪連降糖片中黃連的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 黃芪甲苷（黃芪）的含量測定

2.2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（33:67）；Agilent 1260 Infinity蒸發(fā)光散射檢測器（漂移管溫度30 ℃，載氣流速1.6 L/min）；柱溫：30 ℃；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷計算應(yīng)不低于4000。

2.2.1.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定后置入棕色量瓶，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的對照品溶液。

2.2.1.3 供試品溶液的制備 取芪連降糖片20片，除去包衣后研細，取約3.1 g，精密稱定，置入索氏提取器，加入甲醇40 ml，冷浸過夜，再加入適量甲醇，加熱回流提取4 h。將提取液減壓濃縮干燥后加去離子水10 ml，置溫水上使其溶解后，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次獲得正丁醇萃取液40 ml。將所有正丁醇萃取液混勻后，再分別用40 ml氨試液充分洗滌2次，棄去氨液，正丁醇液減壓濃縮干燥，所得殘渣再次加入5 ml去離子水溶解，待冷卻完全后上樣于D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1 cm，柱高為16 cm），先用水50 ml洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再用30 ml濃度為40 %乙醇洗脫棄去中等極性洗脫液，最后用80 ml濃度為70 %的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥。利用甲醇將殘渣溶解并轉(zhuǎn)移至量瓶中，加甲醇定容至50 ml，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.4 陰性對照溶液的制備 依據(jù)芪連降糖片處方中藥味的比例，稱定相應(yīng)比例的黃連藥材粉末，按其工藝制成空白制劑的藥粉，再按2.2.1.3項方法制得相應(yīng)陰性對照溶液。

2.2.1.5 專屬性試驗 依次吸取以上制備的黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，按2.2.1.1項色譜條件進行測定。結(jié)果表明，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液有對應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，按黃芪甲苷色譜峰計，理論塔板數(shù)為22 753，與前后峰的分離度均較好。表明本研究所建立的色譜條件專屬性良好，適用于芪連降糖片中黃芪甲苷的含量測定。色譜圖見圖3。

圖3 芪連降糖片中黃芪的高效液相色譜圖

2.2.1.6 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇逐級稀釋配制成濃度30.28，60.56，121.13，242.25，484.50，969.00 μg/ml對照品溶液。按2.2.1.1項色譜條件，分別進樣10 μl，記錄色譜圖。以峰面積的對數(shù)（lgA）為縱坐標，黃芪甲苷質(zhì)量濃度對數(shù)（lgC）為橫坐標進行線性回歸分析，得標準曲線方程，lgA=1.6334 lgC+1.9910，相關(guān)系數(shù)r=0.9989。結(jié)果表明，黃芪甲苷在30.28～969.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.7 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（黃芪甲苷含量242.25 μg/ml），按2.2.1.1項色譜條件連續(xù)進樣6次，計算黃芪甲苷峰面積的RSD為1.35 %，表明儀器精密度良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20190401），分別于配制后0，2，4，6，12 h（低溫避光保存）按2.2.1.1項色譜條件進樣，記錄黃芪甲苷峰面積，計算RSD為2.86 %，表明供試品在低溫避光保存條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.9 重復(fù)性試驗 取同一批次芪連降糖片樣品（批號：20190401）共計6份，精密稱定，按2.2.1.3項方法制備供試品溶液，再按2.2.1.1項色譜條件進行測定。結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為3.89 mg/g，RSD為2.57 %，表明此法重復(fù)性良好。

2.2.1.10 加樣回收率試驗 取2.2.1.9項已測定含量的芪連降糖片樣品（批號：20190401）適量，除去包衣后研細，精密稱取6份，每份約1.5 g，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液（1.1 mg/ml）5 ml，按2.2.1.3項供試品溶液制備方法操作，再按2.2.1.1項色譜條件測定含量，計算得黃芪甲苷的平均回收率為98.8 %，RSD為2.25 %，回收率良好，結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.2.1.11 樣品含量測定 精密稱取3批芪連降糖片樣品，按2.2.1.3項方法制備供試品溶液，按2.2.1.1項色譜條件，測定樣品中黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表4。

2.2.2 生物堿類成分（黃連）的含量測定

2.2.2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（48:52）（每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；檢測波長345 nm；柱溫：30 ℃；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2.2.2 混合對照品溶液的制備 取表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定后置棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為30.91，118.88，30.50，520.20 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2.3 供試品溶液的制備 取芪連降糖片樣品20片，除去包衣后研細，取約0.56 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100: 1）混合溶液50 ml，密閉后稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，加入甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2.4 陰性對照溶液的制備 按芪連降糖片處方中藥味的比例，稱定相應(yīng)比例的黃芪藥材粉末，按其工藝制成空白制劑的藥粉，再按2.2.2.3項方法制得相應(yīng)陰性對照溶液。

2.2.2.5 專屬性試驗 分別吸取上述制備的表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，按2.2.2.1項色譜條件測定。結(jié)果表明，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液有對應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，按表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿色譜峰計，理論塔板數(shù)分別為16 715，17 808，18 715和17 725，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。表明建立的色譜條件專屬性良好，適用于芪連降糖片中表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量測定。色譜圖見圖4。

圖4 芪連降糖片中黃連的高效液相色譜圖

2.2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精確吸取混合對照品溶液62.5，125，250，500，1000，2000 μl，置入2 ml量瓶，不足部分加甲醇定容至刻度，搖勻后即得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按2.2.2.1項色譜條件進樣測定。以各對照品的峰面積（A）為縱坐標，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析得到回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿線性關(guān)系及其范圍

2.2.2.7 精密度試驗 精密吸取表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對照品溶液，按2.2.2.1項色譜條件連續(xù)進樣6次，計算表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.99 %，2.53 %，0.52 %和0.36 %，表明儀器精密度良好。

2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20190401），分別于配制后0，3，4，6.5，14 h（低溫避光保存）按2.2.2.1項色譜條件進樣，記錄表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積，計算RSD分別為2.85 %，1.93 %，2.16%和1.89 %，表明供試品溶液在低溫避光保存條件下14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批次芪連降糖片樣品（批號：20190401）共計6份，精密稱定，按2.2.2.3項方法制備供試品溶液，再按2.2.2.1項色譜條件進行測定。結(jié)果表明，表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均含量分別為4.83，15.20，6.17 ，94.69 mg/g；RSD分別為1.51 %，1.26 %，1.24 %，1.04 %。表明此法重復(fù)性良好。

2.2.2.10 加樣回收率試驗 取2.2.2.9項下已測定含量的芪連降糖片樣品（批號：20190401）6份，每份取約0.26 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，分別加入表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量分別為53，140，80，1000 μg/ml的混合對照品溶液25 ml，按2.2.2.3項方法制備供試品溶液，按2.2.2.1項色譜條件測定含量，計算各待測成分的加樣回收率。結(jié)果表明，表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均回收率為97.8 %，101.2 %，98.9 %，97.3 %；RSD為1.89 %，1.35 %，2.40 %，1.25 %，見表3。

表3 表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.2.11 樣品含量測定 精密稱取3批芪連降糖片樣品，按2.2.2.3項方法制備供試品溶液，按2.2.2.1項色譜條件，測定樣品中表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表4。

表4 3批芪連降糖片含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

芪連降糖片由黃芪、黃連（味連）兩味藥組成，均被《中國藥典》收載并明確了相應(yīng)鑒別方法。為了建立較完善的質(zhì)量標準，本品參照《中國藥典》2020年版（一部）和《中國藥典》2015年版（一部）中黃芪、黃連項下的薄層色譜鑒別方法[4-5]，對成品中黃芪和黃連（味連）兩味藥材均建立了薄層色譜鑒別方法。結(jié)果表明，在本實驗選擇的薄層色譜條件下，黃芪和黃連的供試品色譜在與對照品色譜、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的清晰斑點，分離度和重現(xiàn)性良好，陰性樣品無干擾。

3.2 含量測定研究

黃芪甲苷為君藥黃芪主要有效成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡等多種藥理作用[6-10]；表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿為臣藥黃連主要有效成分，可協(xié)同調(diào)節(jié)與糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、胰島β細胞功能相關(guān)的靶點及通路，改善腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，綜合發(fā)揮抗糖尿病作用[11-20]。本文根據(jù)藥典方法[4-5]，并結(jié)合所用蒸發(fā)光散射檢測器特點，經(jīng)過多次優(yōu)化[21]，確定黃芪甲苷的含量測定方法，結(jié)果表明，供試品和對照品均峰型良好無干擾，為最佳色譜條件。

為了全面控制芪連降糖片的質(zhì)量，體現(xiàn)與臨床療效的關(guān)聯(lián)性，本實驗以黃芪甲苷和表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿為指標建立了芪連降糖片的含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗證表明該方法靈敏簡便、穩(wěn)定可行。在黃連生物堿類成分的含量測定中，流動相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液的比例為50:50時，供試品中表小檗堿和鹽酸黃連堿的出峰位置附近有雜質(zhì)干擾且分離度差，因此需將流動相極性增大，延長各物質(zhì)出峰時間保證待測成分分離度良好。本文優(yōu)化后的色譜條件下，供試品和對照品中各待測成分均峰型對稱，分離度良好，陰性對照無干擾。

3.3 關(guān)于含量限度的建議

芪連降糖片規(guī)格為每片重0.56 g，根據(jù)表4中3批樣品含量測定結(jié)果，計算得芪連降糖片每片中黃芪甲苷、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均含量分別為2.1，2.5，7.3，3.8和47.5 mg。考慮實際生產(chǎn)中投料量和工藝的影響，本文建議芪連降糖片含量限度為：本品每片含黃芪以黃芪甲苷（C31H68O14）計，不得少于1.7 mg；本品每片含黃連以表小檗堿（C20H18ClNO4）、鹽酸黃連堿（C19H14ClNO4）、鹽酸巴馬?。–21H22ClNO4）和鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計，分別不得少于2.0，5.8，3.0和38.0 mg。

綜上，本實驗建立了芪連降糖片的薄層色譜鑒別方法，同時采用高效液相色譜法建立了芪連降糖片中5種主要有效成分的含量測定方法，依法測定了3批中試樣品中各成分的含量。方法簡便可靠，結(jié)果準確，專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。