韓平安 ，唐寬剛 ，常 悅 ，孫瑞芬 ，王 良 ，張自強(qiáng) ，付增娟 ，趙尚敏 ，吳新榮 ，李曉東

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)甜菜品種遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

食糖與糧、棉、油同屬涉及國(guó)計(jì)民生的大宗農(nóng)產(chǎn)品，它既是人民生活的必需品，也是我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)，特別是食品和醫(yī)藥行業(yè)及下游產(chǎn)業(yè)的重要基礎(chǔ)原料和國(guó)家重要的戰(zhàn)略物資[1]。世界上約35%的食糖來(lái)源于甜菜[2]，甜菜是我國(guó)兩大糖料作物之一，是重要的特色經(jīng)濟(jì)作物。甜菜不僅是制糖業(yè)重要的基礎(chǔ)原料，還是一種良好的飼料和潛在的能源作物[3]。甜菜為二年生異花授粉作物，采用常規(guī)育種方法獲得純合親本的時(shí)間較長(zhǎng)，育種速度緩慢，單倍體育種可以快速獲得純合體，獲得的二倍體植株為純合的雙單倍體，大大縮短育種進(jìn)程，提高育種效率。前期單倍體誘導(dǎo)技術(shù)主要為體外誘導(dǎo)[4]和體內(nèi)誘導(dǎo)[5]。

基于著絲粒特異性組蛋白基因CENH3的改造是近年來(lái)建立單倍體誘導(dǎo)系的一個(gè)研究熱點(diǎn)。CENH3是著絲粒特異的組蛋白H3突變體，CENH3基因參與著絲粒復(fù)合蛋白的募集和穩(wěn)定，在著絲粒的組裝及染色體的正常分離與傳遞中起著關(guān)鍵作用[6]。因CENH3對(duì)著絲粒區(qū)域的重要性，CENH3改變會(huì)導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤甚至產(chǎn)生致死效應(yīng)[7]。擬南芥中CENH3低表達(dá)量抑制了有絲分裂，導(dǎo)致減數(shù)分裂時(shí)染色體的分離出現(xiàn)錯(cuò)誤[8]。RAVI等[9]通過(guò)對(duì)擬南芥染色體著絲粒的突變體研究，開(kāi)發(fā)出了通過(guò)著絲粒介導(dǎo)使親本之一染色體選擇性丟失，從而獲得單倍體的方法。該研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥CENH3-1的無(wú)效突變體具有致死性。通過(guò)修飾來(lái)改變CENH3可以挽救CENH3-1突變體的致死效應(yīng)。一種是在CENH3的N端融合綠色熒光蛋白，成為GFP-CENH3；另一種是用組蛋白H3.3的N端代替CENH3的N端，并在N端融合GFP，成為GFP-CENH3 tailswap。將兩種修飾的CENH3分別轉(zhuǎn)入擬南芥CENH3致死突變體，轉(zhuǎn)入后植株的野生表型均可恢復(fù)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得GFP-CENH3 tailswap純合植株多數(shù)表現(xiàn)為雄性不育，作為母本與不同基因型的野生型植株雜交后能夠產(chǎn)生25%～50%的父本單倍體，GFP-CENH3植株與野生型雜交，也能誘導(dǎo)單倍體，但頻率低于GFP-CENH3 tailswap植株。玉米和芥菜用類(lèi)似的方法修飾CENH3，并將修飾后的CENH3轉(zhuǎn)入CENH3純合致死突變體，也能得到單倍體植株[10-11]。KARIMIASHTIYANI等[12]研究表明，擬南芥CENH3的點(diǎn)突變就可以獲得單倍體誘導(dǎo)系。

CRISPR/Cas9是一種重要基因組編輯工具，因CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔、靶位點(diǎn)選擇靈活、構(gòu)建簡(jiǎn)單且編輯效率高，使其迅速成為植物基因組編輯主要工具[13-15]。CRISPR/Cas9技術(shù)已成功在水稻[16]、小麥[17]、玉米[18]、棉花[19]等作物上得到了廣泛的應(yīng)用。利用基因組編輯手段，可以創(chuàng)造成單一親本染色體消失的誘導(dǎo)系[20-22]。本研究以甜菜BvCENH3基因?yàn)槟繕?biāo)基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步分析，以期獲得甜菜BvCENH3基因序列改變的突變體，同時(shí)通過(guò)進(jìn)一步研究，建立可用于甜菜自交系培育的雙單體生產(chǎn)體系，旨在為創(chuàng)建甜菜單倍體誘導(dǎo)系進(jìn)而創(chuàng)制優(yōu)良的甜菜新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜菜（Beta vulgaris L.）無(wú)菌苗、載體 pBWA（V）K和pBWA（V）-Cas9、EHA105農(nóng)桿菌菌株由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜分子育種課題組保存。引物設(shè)計(jì)通過(guò)Primer Premier 5.0完成，序列由南京金斯瑞公司合成，相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

以甜菜BvCENH3基因（LOC104907459）為目標(biāo)序列，根據(jù)靶標(biāo)設(shè)計(jì)的原則[23]設(shè)計(jì)BvCENH3基因的2個(gè)特異性靶標(biāo)序列，靶標(biāo)1序列：CCACCTGCTTGCTGCTGCTCCCC，靶標(biāo) 2序列：CCGCGCAGTTTGCAATCACCACA。同時(shí)設(shè)計(jì)擴(kuò)增含2個(gè)靶標(biāo)序列的sgRNA引物（F1/R1和 F2/R2，并引入Eco31Ⅰ酶切位點(diǎn)），序列見(jiàn)表1。將靶標(biāo)1通過(guò) T4連接酶連入中間載體 pBWA（V）-Cas9/BvCENH3-B1，靶標(biāo) 2連入中間載體 pBWD/BvCENH3-B2。用LguⅠ酶切2個(gè)中間載體pBWA（V）-Cas9/BvCENH3-B1和 pBWD/BvCENH3-B2，并用T4連接酶進(jìn)行連接，獲得含有雙靶標(biāo)的重組載體命名為CRISPR-Cas9/BvCENH3。靶標(biāo)反應(yīng)條件，中間載體構(gòu)建酶切連接反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，雙靶標(biāo)載體構(gòu)建酶切連接反應(yīng)體系、反應(yīng)條件均參照韓平安等[24]的方法進(jìn)行。將雙靶標(biāo)重組載體CRISPR-Cas9/BvCENH3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，待菌落出現(xiàn)后，用引物F3/R3進(jìn)行PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆并測(cè)序。提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。用特異性引物F3/R3進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。PCR 檢測(cè)體系（20 μL）：2×Mix 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，ddH2O 7 μL，菌液 1 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴(kuò)增條帶大小為1 250 bp。

1.2.2 甜菜的遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.2.1 菌液的制備

挑取農(nóng)桿菌單菌落于加有卡那霉素（Kan，100 mg/L）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃黑暗條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h后，將菌液置于離心管中，5 000 r/min離心5 min收集菌體，重新懸浮菌液，OD600值為 0.4～0.5，備用。

1.2.2.2 侵染和共培養(yǎng)

將在分化培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+瓊脂7 g/L，pH值為5.8，pH值下同）上預(yù)培養(yǎng)7 d左右的甜菜葉柄置于農(nóng)桿菌菌液中，置于搖床上（100 r/min），28℃侵染20 min后，移除菌液，將葉柄接種在共培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+AS 300 μmol/L+瓊脂7 g/L）上，25℃暗培養(yǎng)3 d。

1.2.2.3 抗性篩選與植株再生

葉柄與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)移到含有Kan（50 mg/L）的篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA 1 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+頭孢霉素250 mg/L+Kan 50 mg/L+瓊脂7 g/L）中培養(yǎng)，每隔7 d轉(zhuǎn)接1次。當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)，將其從外植體上切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+NAA 1 mg/L+瓊脂7 g/L）中誘導(dǎo)生根。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

剪取Kan抗性植株幼葉，利用高通量核酸提取儀（KingFisher Flex，Thermo Fisher）提取基因組 DNA，具體步驟按磁珠法植物DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以DNA為模板，用特異性引物F4/R4擴(kuò)增抗性基因Kan進(jìn)行陽(yáng)性植株檢測(cè)，擴(kuò)增條帶大小為500 bp，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序同1.2.1。

1.2.2.5 突變檢測(cè)

提取陽(yáng)性植株的DNA樣品進(jìn)行二代測(cè)序。利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與野生型甜菜BvCENH3序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得靶位點(diǎn)突變植株。

1.2.2.6 目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)

利用微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)，首先對(duì)BvCENH3基因的擴(kuò)增引物F5/R5和內(nèi)參基因GS的擴(kuò)增引物F6/R6的特異性進(jìn)行檢測(cè)。之后用特異引物對(duì)突變體植株進(jìn)行BvCENH3基因插入拷貝數(shù)檢測(cè)。內(nèi)參基因（GS）在甜菜中拷貝數(shù)為1。ddPCR擴(kuò)增體系、擴(kuò)增程序見(jiàn)韓平安等[25]的方法。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)試驗(yàn)。外源基因拷貝數(shù)的計(jì)算方法：外源基因拷貝數(shù)=外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA雙靶標(biāo)CRISPR-Cas9/BvCENH3載體的構(gòu)建

目的片段與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑取9個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得1 250 bp片段，符合目的條帶大?。▓D1）。將陽(yáng)性克隆測(cè)序后與人工合成序列比對(duì)，證實(shí)獲得序列完全正確。將測(cè)序正確質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，獲得目的條帶（圖2），證明編輯載體構(gòu)建成功，為CRISPR-Cas9/BvCENH3。

圖1 sgRNA雙靶標(biāo)CRISPR-Cas9/BvCENH3載體大腸桿菌菌液擴(kuò)增圖譜Figure 1 Amplification of sgRNA dual-target CRISPR-Cas9/BvCENH 3 vector E.coli solution

圖2 sgRNA雙靶標(biāo)載體CRISPR-Cas9/BvCENH 3農(nóng)桿菌菌液擴(kuò)增圖譜Figure 2 Amplification of the sgRNA dual-target vector CRISPR-Cas9/BvCENH3 agrobacterium solution

2.2 抗性植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜葉柄，通過(guò)Kan（50 mg/L）篩選獲得抗性叢生芽（圖3），待根系長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)移栽至花盆。

圖3 甜菜的遺傳轉(zhuǎn)化Figure 3 Genetic transformation of sugar beet

2.3 轉(zhuǎn)基因甜菜的PCR檢測(cè)

將獲得的抗性植株進(jìn)行Kan抗性基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，共有82株植株片段為500 bp，符合預(yù)期條帶大小（圖4），初步判斷目的基因已整合到甜菜染色體基因組中，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖4 部分轉(zhuǎn)基因甜菜植株的PCR檢測(cè)Figure 4 PCR detection of some transgenic sugar beet plants

2.4 突變檢測(cè)

將陽(yáng)性植株的DNA樣品進(jìn)行二代測(cè)序。利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與野生型甜菜BvCENH3基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，82個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有40個(gè)被成功編輯，編輯效率為48.78%，突變類(lèi)型有單堿基替換（T→G、A→C）、堿基缺失（TC、TCTC）等5種突變類(lèi)型（表2）。突變類(lèi)型1共有19個(gè)株系，其中第1條染色體的靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）、4個(gè)堿基（TCTC）缺失，第2條染色體靶標(biāo)1上發(fā)生單堿基替換（T→G）、靶標(biāo)1附近有單堿基替換（A→C）和4個(gè)堿基（TCTC）缺失。突變類(lèi)型2共有6個(gè)株系，其中，第1條染色體靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）、2個(gè)堿基（TC）缺失，第 2條染色體在靶標(biāo)1上發(fā)生單堿基替換（T→G）、靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）和4個(gè)堿基（TCTC）缺失。突變類(lèi)型3共有11個(gè)株系，其中，第1條染色體靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）、4個(gè)堿基（TCTC）缺失，第2條染色體未發(fā)生突變。突變類(lèi)型4有2個(gè)株系，其中，第1條染色體靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）、2個(gè)堿基（TC）缺失，第2條染色體靶標(biāo)1附近發(fā)生單堿基替換（A→C）和4個(gè)堿基堿基（TCTC）缺失。突變類(lèi)型5有2個(gè)株系，其中，第1條染色體未發(fā)生突變，第2條染色體在靶標(biāo)2附近發(fā)生單堿基替換（A→C）。

表2 轉(zhuǎn)基因植株突變類(lèi)型Table 2 Mutation types of transgenic plants

2.5 目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)

利用ddPCR技術(shù)對(duì)突變植株進(jìn)行目的基因插入拷貝數(shù)檢測(cè)。首先以甜菜GS為內(nèi)參基因，對(duì)目的基因擴(kuò)增引物的特異性進(jìn)行檢測(cè)。由圖5可知，2個(gè)基因?qū)?yīng)引物的陽(yáng)性微滴（藍(lán)色帶）與陰性微滴（黑色帶）都能明顯區(qū)分開(kāi)，表明目的基因引物的特異性較好。其次，對(duì)ddPCR的重復(fù)性進(jìn)行分析，所有樣品BvCENH3和GS基因的試驗(yàn)有效微滴總數(shù)均大于20 000（表3），滿(mǎn)足微滴數(shù)字PCR微滴的分析要求，試驗(yàn)中生成微滴的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）介于 2%～5%（表 4），小于 25%，符合歐盟核酸定量檢測(cè)的要求，說(shuō)明試驗(yàn)中建立的微滴數(shù)字PCR體系微滴生成穩(wěn)定，重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)可靠性高。對(duì)40個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行目的基因拷貝數(shù)分析，獲得23個(gè)低拷貝株系，BvCENH3插入拷貝數(shù)為1.1～1.9（表 4）。

圖5 ddPCR引物特異性檢測(cè)Figure 5 ddPCR primer specificity test

表3 ddPCR重復(fù)性分析Table 3 Repeatability analysis of ddPCR

表4 部分轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)分析Table 4 Copy number analysis of some transgenic plants

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9技術(shù)憑借其精準(zhǔn)、高效、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，以前所未有的速度和效率打破了傳統(tǒng)育種的瓶頸，迅速成為生物學(xué)領(lǐng)域中的強(qiáng)大工具[26]。在水稻上，采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)3個(gè)（Bsr-d1、Pi21和ERF922）已知的稻瘟病抗性相關(guān)基因進(jìn)行基因編輯研究，發(fā)現(xiàn)單基因突變體和3基因突變體的稻瘟病抗性均顯著高于野生型品種[27]。在水稻研究中還發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)早秈品種中早70敲除TMS5，獲得了敗育穩(wěn)定的溫敏不育系材料[28]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯小麥ARE1基因提高了小麥的氮素利用效率及田間產(chǎn)量[29]。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)在玉米[30]、大豆[31]、油菜[32]等作物中均得到了較好應(yīng)用。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)甜菜BvCENH3基因進(jìn)行編輯，成功獲得突變體，為甜菜單倍體育種提供了試驗(yàn)材料和理論基礎(chǔ)。

著絲粒特異性組蛋白CENH3在細(xì)胞分裂中起重要作用，著絲粒功能的改變與染色體的消除有關(guān)，能夠誘導(dǎo)單倍體植株的形成[33]。研究者開(kāi)發(fā)出CENH3介導(dǎo)的單倍體育種技術(shù)，先后在擬南芥、玉米和小麥等作物得到成功應(yīng)用。在擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)，CENH3改變會(huì)導(dǎo)致合子發(fā)育過(guò)程中親本染色體消除而產(chǎn)生單倍體[9]。在玉米研究中發(fā)現(xiàn)，CENH3突變體的雜交后代中有近0.86%的種子為單倍體[10]。通過(guò)基因編輯技術(shù)編輯小麥的著絲粒組蛋白TaCENH3α，篩選鑒定到小麥父本單倍體誘導(dǎo)系，其效率為7%，為CENH3單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在多種作物中的應(yīng)用鋪平道路[34]。甜菜分子育種課題組前期采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)煙草CENH3基因進(jìn)行編輯，獲得6株突變植株[23]。本研究基于前期基礎(chǔ)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)甜菜BvCENH3基因進(jìn)行編輯，獲得40株編輯植株，編輯效率為48.78%。本研究針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)2個(gè)靶標(biāo)，靶標(biāo)1有4種突變類(lèi)型，靶標(biāo)2僅有1種突變類(lèi)型，靶標(biāo)1的編輯效率明顯優(yōu)于靶標(biāo)2，說(shuō)明同一基因不同靶標(biāo)編輯效率不同，載體的編輯效率與靶標(biāo)有較大的相關(guān)性[35]。因此，為確保目標(biāo)基因的高效編輯，應(yīng)設(shè)計(jì)2個(gè)及2個(gè)以上的靶標(biāo)[36]。此外，甜菜分子育種課題組還構(gòu)建了互補(bǔ)載體GFP-CENH3 tailswap且獲得了轉(zhuǎn)基因植株。后期會(huì)將以上兩個(gè)載體的獲得陽(yáng)性植株進(jìn)行雜交，同時(shí)進(jìn)行表型鑒定與育性鑒定。

本研究采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)甜菜葉柄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得82株轉(zhuǎn)基因植株，其中40株被成功編輯，編輯效率為48.78%，靶標(biāo)1效率優(yōu)于靶標(biāo)2；突變類(lèi)型有單堿基替換（T→G、A→C）、堿基缺失（TC 、TCTC 缺失）等5種突變類(lèi)型；篩選出23株低拷貝編輯植株，BvCENH3插入拷貝數(shù)為1.1～1.9。本研究初步創(chuàng)建了甜菜基因組編輯技術(shù)體系，為甜菜單倍育種奠定了理論與技術(shù)基礎(chǔ)。