李培倫 ，劉嘉成 ，魯萬(wàn)橋 ，王繼隆

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱 150070；2.黑龍江省冷水性魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150070；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150070）

鹽度是魚(yú)類(lèi)棲居水環(huán)境中重要的生境因子，能夠影響魚(yú)類(lèi)的存活、生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖習(xí)性，尤其對(duì)海水養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)來(lái)講，適當(dāng)?shù)柠}度改變能夠?qū)ζ鋽z食行為、生長(zhǎng)性能及組織器官的發(fā)育起到一定的促進(jìn)作用，但鹽度改變幅度過(guò)大則會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)造成不利影響[1-2]。同時(shí)，水體中鹽度的改變會(huì)引起魚(yú)體發(fā)生各種應(yīng)激反應(yīng)，通常會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧分子，為防止其對(duì)魚(yú)體造成損害，魚(yú)類(lèi)物種在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了特定的抗氧化機(jī)制[3-4]。肝臟是魚(yú)體進(jìn)行各類(lèi)物質(zhì)代謝的重要器官，亦是參與氧化還原反應(yīng)較多的組織，內(nèi)含各種抗氧化酶和水解酶類(lèi)，這些酶可通過(guò)機(jī)體的免疫防御體系抵御外界的各類(lèi)脅迫和侵害[5-6]。ATP酶廣泛存在于生物機(jī)體內(nèi)，既能穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)、外的滲透壓平衡，又能為機(jī)體物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝等生化過(guò)程提供動(dòng)力，其活力強(qiáng)度可用于評(píng)價(jià)機(jī)體的離子運(yùn)載能力[7]。研究表明，鹽度改變能夠引起魚(yú)類(lèi)鰓ATP酶、肝臟的抗氧化功能發(fā)生適應(yīng)性變化，進(jìn)而對(duì)其存活率、生長(zhǎng)性能等造成影響，這些生理生化指標(biāo)的變化能反映鹽度對(duì)魚(yú)體健康的影響程度[5-9]。

大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus keta）主要分布于北緯35°～73°，東經(jīng) 120°～123°，是北太平洋沿岸國(guó)家重要的商業(yè)捕撈魚(yú)類(lèi)之一[10]。大麻哈魚(yú)一生經(jīng)歷幼魚(yú)降海生長(zhǎng)、成魚(yú)溯河繁殖兩個(gè)海水、淡水適應(yīng)階段，是典型的江海洄游性魚(yú)類(lèi)[11]。自20世紀(jì)70年代起，由于全球范圍內(nèi)氣候變遷、過(guò)度商業(yè)捕撈、興修各類(lèi)水利工程等因素，導(dǎo)致大麻哈魚(yú)的自然資源儲(chǔ)量嚴(yán)重下降[12-13]。為恢復(fù)我國(guó)大麻哈魚(yú)的種群資源，政府部門(mén)及科研單位不斷開(kāi)展增殖放流，積極探索其人工養(yǎng)殖技術(shù)，取得了一定的成效[13-16]。目前，有關(guān)大麻哈魚(yú)人工養(yǎng)殖方面的研究較少，涉及生長(zhǎng)[14]、肌肉營(yíng)養(yǎng)[17]、性腺發(fā)育[18]、血液生理及消化酶[19]等方面，而有關(guān)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)生長(zhǎng)性能、鰓ATP酶及肝臟抗氧化功能方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究了鹽度改變對(duì)大麻哈魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響，明確了鰓ATP酶活力及肝臟抗氧化功能面對(duì)鹽度脅迫時(shí)的響應(yīng)情況，以期為人工環(huán)境下大麻哈魚(yú)養(yǎng)殖條件的摸索提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖車(chē)間，挑選24尾生長(zhǎng)狀況良好的大麻哈魚(yú)（2齡）在控溫水族箱內(nèi)開(kāi)展試驗(yàn)，試驗(yàn)魚(yú)的體質(zhì)量為265.3～321.2 g、叉長(zhǎng)為25.2～28.9 cm。試驗(yàn)設(shè)置淡水（CK）、鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰ 4個(gè)處理，每個(gè)處理隨機(jī)放入6尾試驗(yàn)魚(yú)。用地下井水和海水素調(diào)配試驗(yàn)用水，并用哈希HQ4300鹽度計(jì)校對(duì)各處理的鹽度值。試驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)量魚(yú)的初始體質(zhì)量（initial body mass，Wi），試驗(yàn)過(guò)程中水溫設(shè)置為15℃，充分曝氣使水體溶解氧含量≥9 mg/L。每天7：00—8：00、16：00—17：00 分別投喂鮭魚(yú)飼料 1 次。此外，試驗(yàn)期間統(tǒng)計(jì)魚(yú)的存活率，每7 d換水1次，42 d（2齡）后結(jié)束試驗(yàn)。

1.2 樣品制備

取樣前1 d停止喂食，麻醉后將試驗(yàn)魚(yú)放置在冰盤(pán)上，先測(cè)量終末體質(zhì)量（terminal body mass，Wt），后解剖取鰓和肝臟組織，經(jīng)4℃去離子水沖洗后放入-80℃冰箱。測(cè)定前分別對(duì)鰓和肝臟組織解凍，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿液，4℃下2 500 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.2.1 酶活力的測(cè)定

用試劑盒（南京建成）測(cè)定鰓三磷酸腺苷酶（ATP酶）活力，肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的活力，肝臟總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.2.2 生長(zhǎng)性能測(cè)定與計(jì)算

試驗(yàn)開(kāi)展42 d后，分析各處理試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)性能，計(jì)算方法如下

體質(zhì)量增長(zhǎng)率/%＝［（Wt－Wi）/Wi］×100（1）

特定生長(zhǎng)率/（%/d）＝［（ln Wt－ln Wi）/t］×100（2）

存活率/%＝（St/Si）×100（3）

上述公式中，Wi為試驗(yàn)魚(yú)的初始體質(zhì)量（g）；Wt為試驗(yàn)魚(yú)的終末體質(zhì)量（g）；Si為初始試驗(yàn)魚(yú)尾數(shù)（條）；St為終末試驗(yàn)魚(yú)尾數(shù)（條）；t為試驗(yàn)開(kāi)展的時(shí)間（d）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007、SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)的生長(zhǎng)性能

大麻哈魚(yú)在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡情況，各處理的存活率均為100%（表1）。由表1可知，大麻哈魚(yú)的體質(zhì)量增長(zhǎng)率、特定生長(zhǎng)率均隨鹽度的升高呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，其中鹽度8‰處理大麻哈魚(yú)的生長(zhǎng)狀況最好，其體質(zhì)量增長(zhǎng)率為29.41%、特定生長(zhǎng)率為0.61%/d，而淡水（CK）處理大麻哈魚(yú)的體質(zhì)量增長(zhǎng)率和特定生長(zhǎng)率均最低，分別為16.62%和0.36%/d。方差分析結(jié)果表明，鹽度8‰處理大麻哈魚(yú)的終末體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)率和特定生長(zhǎng)率顯著高于淡水（CK）和鹽度 24‰處理（P＜0.05）；鹽度16‰處理大麻哈魚(yú)的終末體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)率和特定生長(zhǎng)率與其他各處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)的存活率和生長(zhǎng)情況Table 1 Effects of salinity on survival rate and growth performance of farmed chum salmon

2.2 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)鰓ATP酶的活力水平

由表2可知，養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)鰓Na+/K+-ATP酶活力為1.07～1.89 U/mg，Ca2+/Mg2+-ATP酶活力為0.81～1.46 U/mg。大麻哈魚(yú)鰓Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力變化趨勢(shì)均隨鹽度的升高先上升后下降，其中，鹽度8‰處理兩種ATP酶活力最高，淡水（CK）處理兩種ATP酶活力最低。方差分析結(jié)果表明，鹽度8‰、鹽度16‰、鹽度24‰處理與淡水（CK）處理間的Na+/K+-ATP酶活力具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度16‰處理和鹽度24‰處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。鹽度8‰處理的Ca2+/Mg2+-ATP酶活力與其他各處理間均具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度24‰處理與淡水（CK）、鹽度 16‰處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；鹽度16‰處理與淡水（CK）處理間的Ca2+/Mg2+-ATP酶活力具有顯著差異（P＜0.05）。

表2 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)鰓ATP酶活力的影響Table 2 Effect of salinity on gill ATPase activity of farmed chum salmon

2.3 不同鹽度處理養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟的抗氧化功能

2.3.1 養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟抗氧化酶的活力水平

由表3可知，大麻哈魚(yú)肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活力均隨鹽度升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中，鹽度16‰處理酶活力最高，淡水（CK）處理酶活力最低；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的變化趨勢(shì)隨鹽度升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中，鹽度16‰處理酶活力最低，鹽度24‰處理酶活力最高。方差分析結(jié)果表明，淡水（CK）處理與鹽度8‰處理、鹽度24‰處理、鹽度16‰處理間的SOD活力具有顯著差異（P＜0.05）；鹽度8‰處理和鹽度24‰處理間的SOD活力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。鹽度24‰處理GSH-PX活力顯著（P＜0.05）高于淡水（CK）、鹽度 8‰和鹽度 16‰處理；淡水（CK）、鹽度8‰和鹽度16‰處理間的GSH-PX活力無(wú)顯著差異（P＞0.05）；CAT活力在各鹽度處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟抗氧化酶活力的影響Table 3 Effect of salinity on antioxidant enzyme activities in the liver of farmed chum salmon

2.3.2 養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活力水平

由表4可知，大麻哈魚(yú)酸性磷酸酶（ACP）活力為75.16～78.80 U/g，堿性磷酸酶（AKP）活力為37.02～42.54 U/g。各處理大麻哈魚(yú)ACP活力均隨鹽度的升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中，鹽度16‰處理酶活力最高，淡水（CK）處理最低；AKP活力隨鹽度的升高逐漸下降。方差分析結(jié)果顯示，ACP活力在各處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；AKP活力淡水（CK）處理顯著（P＜0.05）高于其他各處理，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理間的AKP活力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響Table 4 Effect of salinity on activities of ACP and AKP in the liver of farmed chum salmon

2.3.3 養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟總抗氧化能力和丙二醛含量

由表5可知，養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟總抗氧化能力（T-AOC）為120.52～126.88 mmol/mg，其中，鹽度8‰處理T-AOC最高，為126.88 mmol/mg；淡水（CK）處理最低，為 120.52 mmol/mg。丙二醛（MDA）含量為 2.27～2.75 mmol/mg，其中，淡水（CK）處理含量最高，為2.75 mmol/mg；鹽度8‰處理最低，為2.27 mmol/mg。方差分析結(jié)果顯示，淡水（CK）處理的MDA含量顯著（P＜0.05）高于其他各處理，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理間的MDA含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；肝臟T-AOC在各處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟總抗氧化能力和丙二醛含量的影響Table 5 Effect of salinity on total antioxidant function and malondialdehyde content in the liver of farmed chum salmon

3 討論與結(jié)論

3.1 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

魚(yú)類(lèi)生存的水環(huán)境發(fā)生較大變化時(shí)魚(yú)體會(huì)產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng)，通常最先顯現(xiàn)的是行為活力、能力方面的變化[20]。在本試驗(yàn)開(kāi)始后鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的大麻哈魚(yú)均表現(xiàn)出適應(yīng)性的行為變化，如游泳速度增快、撞擊玻璃缸壁等現(xiàn)象，待其狀態(tài)穩(wěn)定后的1～5 d，試驗(yàn)魚(yú)又出現(xiàn)了呼吸頻率增強(qiáng)、攝食能力下降及長(zhǎng)時(shí)間停滯等狀況，且隨鹽度的升高，這些行為持續(xù)的時(shí)間也相應(yīng)變長(zhǎng)，與硬頭鱒（Oncorhynchus mykiss）[2]、點(diǎn)籃子魚(yú)（Siganus guttatus）[21]等魚(yú)類(lèi)面對(duì)鹽度脅迫時(shí)表現(xiàn)出的狀態(tài)相似。李培倫等[22]對(duì)大麻哈魚(yú)幼魚(yú)在不同鹽度下的存活率進(jìn)行了研究，指出24‰的鹽度條件下其存活率最低，僅為83.34%，而本試驗(yàn)中2齡大麻哈魚(yú)在各處理的存活率均為100%，說(shuō)明大麻哈魚(yú)與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)相似，隨著規(guī)格的增大，其對(duì)鹽度的適應(yīng)能力不斷增強(qiáng)，存活率亦隨之提高。通常魚(yú)類(lèi)在其等滲點(diǎn)附近的水體中生活時(shí)具有較高的生長(zhǎng)速率，而廣鹽性魚(yú)類(lèi)等滲點(diǎn)的鹽度區(qū)間為10‰～13‰[23-24]。目前，有關(guān)大麻哈魚(yú)在養(yǎng)殖水體中的等滲點(diǎn)鹽度未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)中鹽度8‰處理大麻哈魚(yú)的體質(zhì)量增長(zhǎng)率和特定生長(zhǎng)率均最高，鹽度16‰處理次之，推斷該生長(zhǎng)階段其等滲點(diǎn)的鹽度介于8‰～16‰。

3.2 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)鰓ATP酶的影響

研究表明，當(dāng)魚(yú)類(lèi)棲息水體的鹽度發(fā)生改變時(shí)，魚(yú)體長(zhǎng)期維持的內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境將會(huì)被打破，為保持魚(yú)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，需要借助鰓組織中泌氯細(xì)胞的ATP酶活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，但鰓ATP酶活力的變化趨勢(shì)在不同物種之間存在差異[25-26]。尹飛等[3]對(duì)銀鯧（Pampus argenteus）幼魚(yú)在低鹽脅迫后鰓中ATP酶（Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶）的活力進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其活力隨鹽度降低總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；羅海忠等[27]研究指出，四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）在經(jīng)受30 d的鹽度脅迫后鰓中Na+/K+-ATP酶的活力隨鹽度升高而不斷上升；曾霖等[28]研究指出，大菱鲆（Scophthalmus maximus）經(jīng)60 d的鹽度脅迫后其鰓Na+/K+-ATP酶活力亦隨鹽度的升高而不斷增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，在鹽度脅迫下不同魚(yú)類(lèi)的鰓ATP酶活力會(huì)呈現(xiàn)不同的適應(yīng)機(jī)制。本試驗(yàn)中，養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)鰓中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力均隨鹽度的升高表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的酶活力均高于淡水（CK）處理，說(shuō)明養(yǎng)殖水體中適量的鹽度能夠刺激大麻哈魚(yú)鰓ATP酶活力的提升，但超出一定范圍后其活力會(huì)出現(xiàn)不同程度下降。

3.3 鹽度對(duì)養(yǎng)殖大麻哈魚(yú)肝臟抗氧化功能的影響

SOD、CAT和GSH-PX是機(jī)體重要的抗氧化酶類(lèi)，且在機(jī)體抗氧化功能發(fā)揮上具有一定協(xié)同作用，其中SOD可將機(jī)體內(nèi)活性氧分子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧氣，而GSH-PX和CAT能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫分解為水，從而降低其對(duì)機(jī)體的損傷程度[29-30]。本試驗(yàn)中，養(yǎng)殖水體鹽度的改變激發(fā)了大麻哈魚(yú)肝臟內(nèi)SOD、CAT活力的提升，但是GSH-PX與CAT的活力變化趨勢(shì)相反，推斷這兩種酶在執(zhí)行功能時(shí)產(chǎn)生了拮抗作用，該現(xiàn)象也在銀鯧[3]、刀鱭（Coilia nasus）[26]、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）[31]、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）[32]等水產(chǎn)動(dòng)物中出現(xiàn)。ACP和AKP是機(jī)體重要的水解酶類(lèi)，在免疫防御體系中可催動(dòng)磷酸酯類(lèi)物質(zhì)水解成磷酸，促進(jìn)ATP酶的生成，為機(jī)體抵抗環(huán)境脅迫供能[26]。本試驗(yàn)中，大麻哈魚(yú)肝臟ACP酶活力在各處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而AKP酶活力隨著鹽度的升高逐漸下降，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理AKP活力顯著低于淡水（CK）處理（P＜0.05），推斷該階段生活在淡水中的大麻哈魚(yú)需要維持較高的酶活力來(lái)滿足魚(yú)體對(duì)ATP的需求，而咸水環(huán)境下肝臟對(duì)ATP酶的需求降低，故AKP酶活力受到抑制。

T-AOC是機(jī)體各類(lèi)抗氧化分子及酶促反應(yīng)體系抗氧化能力的總和，通常T-AOC升高時(shí)，魚(yú)體清除活性氧分子的能力會(huì)增強(qiáng)，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物則相應(yīng)減少[4]。MDA是機(jī)體脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)過(guò)氧化后形成的代謝產(chǎn)物，可與核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而損傷機(jī)體，通常情況下機(jī)體MDA的含量較低[5，33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，同淡水（CK）處理相比，鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的大麻哈魚(yú)肝臟T-AOC有所增加，說(shuō)明水體中的鹽度能夠促進(jìn)大麻哈魚(yú)肝臟抗氧化功能的增強(qiáng)；隨著鹽度升高M(jìn)DA含量呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢(shì)，其中鹽度8‰處理含量最低，且鹽度8‰、鹽度16‰和鹽度24‰處理的MDA含量顯著低于淡水（CK）處理，這一結(jié)果與其總抗氧化能力（T-AOC）相適應(yīng)，說(shuō)明魚(yú)體T-AOC增加時(shí)清除體內(nèi)過(guò)量的氧化自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的能力增強(qiáng)，從而使MDA含量下降。

大麻哈魚(yú)人工養(yǎng)殖過(guò)程中，鹽度改變會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)性能產(chǎn)生一定影響，同時(shí)鰓ATP酶、肝臟抗氧化功能等均會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化，以便更好地適應(yīng)水體的鹽度環(huán)境。盡管大麻哈魚(yú)在0～24‰的鹽度范圍內(nèi)均具有較高成活率，但其生長(zhǎng)速度卻存在一定差異。整體來(lái)講，處于2齡生長(zhǎng)階段的大麻哈魚(yú)在8‰～16‰的鹽度范圍內(nèi)具有較快的生長(zhǎng)速率及生理適應(yīng)能力，建議2齡生長(zhǎng)階段養(yǎng)殖水體的鹽度保持在8‰～16‰。