石秀娟,魏易洪,鄭 望,曹 敏,鄧 兵,苑素云,周 端,唐靖一

參蛤散,原名獨(dú)圣餅子,最早見(jiàn)于北宋《圣濟(jì)總錄》中,由人參和蛤蚧兩味藥物組成,主治“肺氣咳嗽,面腫,四肢浮”[1]。前期臨床研究顯示,參蛤散可改善慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)病人心功能,從而改善胸悶、氣促等臨床癥狀[2],提高心室收縮功能,降低血清N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)及腦鈉肽(BNP)水平[3-4]。基礎(chǔ)研究顯示,參蛤散可改善壓力負(fù)荷性心力衰竭大鼠的心功能及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[5-6]。上述研究結(jié)果說(shuō)明參蛤散具有較好的抗心力衰竭作用。心力衰竭是心臟結(jié)構(gòu)、功能的異常改變,由多種原因?qū)е?最終發(fā)生心室收縮、舒張功能障礙,主要表現(xiàn)為呼吸困難、勞累、乏力及液體潴留等[7]?！吨袊?guó)心血管病報(bào)告2018》顯示,我國(guó)心力衰竭病人約450萬(wàn)例,患病率隨年齡增加而顯著升高,住院病死率約為4.1%[8],是臨床常見(jiàn)的慢性疾病。促進(jìn)心肌血管生長(zhǎng),延緩病人病程發(fā)展,增強(qiáng)心臟功能,是治療心力衰竭的重要研究方向[9]。本研究觀察參蛤散對(duì)斑馬魚(yú)血管生長(zhǎng)的干預(yù)作用,探討參蛤散是否可促進(jìn)血管生長(zhǎng),從促進(jìn)血管生長(zhǎng)方面探討參蛤散改善心力衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(fli1a-EGFP),由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室提供,溫度(28.5±1)℃,循環(huán)水飼養(yǎng),飼養(yǎng)方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 參蛤散是由中藥生曬參和蛤蚧組成,購(gòu)自上海雷允上藥業(yè)有限公司(人參批號(hào):130705,蛤蚧批號(hào):XD13121605)[2]。蛤蚧去頭足,按照生曬參與蛤蚧按3∶1質(zhì)量比例混勻后制成參蛤散[6]。參蛤散水煎液的配制:加入生藥質(zhì)量體積10倍的蒸餾水;大火煎煮至沸騰;沸騰后轉(zhuǎn)小火,微沸濃縮;至一定體積后,再次加入等體積的蒸餾水;大火煎煮沸騰后,小火濃縮至1 g/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ,VRI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,在二甲基亞砜(DMSO)中溶解,配制成100 mmol/L儲(chǔ)備液,-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。Olympus BX50顯微鏡:日本Olympus公司。28.5 ℃培養(yǎng)箱由德國(guó)Heraues公司提供。

1.4 方法

1.4.1 參蛤散水煎液干預(yù)斑馬魚(yú)正常血管生長(zhǎng)的作用 取成熟期健康斑馬魚(yú)3對(duì)或4對(duì),雌雄比例為1∶1或1∶2,放入帶隔板的交配缸中,次日清晨08:00抽去隔板,10:00觀察產(chǎn)卵情況,并收集斑馬魚(yú)交配產(chǎn)下的受精胚胎,使用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中,置于28.5 ℃孵化箱中培養(yǎng)。24 h后,觀察斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)情況,選擇狀態(tài)良好的胚胎,顯微鏡下使用鑷子去除胚胎卵殼,胚胎培養(yǎng)液稀釋參蛤散水煎液至100 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL和3 μg/mL,按照每孔1 mL加入24孔板中,正常組加入胚胎培養(yǎng)液(每孔1 mL),按照每孔至少8條,將斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于裝有培養(yǎng)液的24孔板中。繼續(xù)在28.5 ℃孵箱中培養(yǎng)至24 h,清洗加藥孔,重新加入培養(yǎng)液及對(duì)應(yīng)濃度的藥液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察腸下靜脈,方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

1.4.2 參蛤散水煎液干預(yù)VRI損傷后斑馬魚(yú)節(jié)間血管的作用 選擇狀態(tài)良好、28.5 ℃孵化箱培養(yǎng)至24 h的斑馬魚(yú)胚胎,顯微鏡下使用鑷子剝開(kāi)胚胎卵殼后,按照每孔至少8條,將斑馬魚(yú)幼魚(yú)放入裝有胚胎培養(yǎng)液(每孔1 mL)的24孔板中。在胚胎培養(yǎng)液中加入VRI至濃度45 μmol/L,再用已加入VRI的培養(yǎng)液稀釋參蛤散水煎液至100 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL和3 μg/mL,將培養(yǎng)液作為正常組,加入VRI的孔為VRI組,置入28.5 ℃孵箱中培養(yǎng)至24 h后觀察脊背節(jié)間血管,方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

1.5 觀察指標(biāo) 將藥物干預(yù)后的斑馬魚(yú)置于載玻片上,除去多余水分,采用熒光顯微鏡觀察正常斑馬魚(yú)模型的腸下靜脈直徑(使用Image J軟件測(cè)量)、平均出芽數(shù)(出芽數(shù)/該組斑馬魚(yú)數(shù))、平均交叉數(shù)(交叉數(shù)/該組斑馬魚(yú)數(shù));觀察斑馬魚(yú)血管損傷模型的脊背節(jié)間血管的完整型血管(intact vessels)與缺陷型血管(defective vessels)個(gè)數(shù),方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié) 果

2.1 參蛤散水煎液對(duì)斑馬魚(yú)腸下靜脈的影響 參蛤散各濃度組腸下靜脈平均出芽數(shù)、平均交叉數(shù)及血管直徑與正常組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1、圖1。

圖1 參蛤散水煎液對(duì)斑馬魚(yú)腸下靜脈的影響(→表示血管出芽;表示血管交叉)

表1 參蛤散水煎液對(duì)斑馬魚(yú)腸下靜脈的影響

2.2 參蛤散水煎液對(duì)VRI損傷后斑馬魚(yú)節(jié)間血管的影響 與正常組比較,VRI組參蛤散各濃度組完整型血管減少(P<0.01),缺陷型血管增多(P<0.01);與VRI組比較,參蛤散各濃度完整型血管增多(P<0.01),缺陷型血管減少(P<0.01)。參蛤散3 μg/mL組完整型血管數(shù)最多(P<0.01),缺陷型血管數(shù)最少(P<0.01)。詳見(jiàn)表2、圖2。

圖2 參蛤散水煎液對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管的影響(→表示血管損傷)

表2 參蛤散水煎液對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管的影響(±s) 單位:條

3 討 論

心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段,引起病人活動(dòng)耐量和生活質(zhì)量下降,由于心臟射血功能減弱,同時(shí)造成人體其他器官血液灌注不足,從而引發(fā)其他系統(tǒng)疾病。中醫(yī)藥對(duì)心力衰竭有較好的治療效果。參蛤散是由中藥人參與蛤蚧組成,方中人參大補(bǔ)元?dú)?蛤蚧補(bǔ)肺、納氣平喘,有補(bǔ)肺腎、定喘嗽之功。在“心肺同治”“異病同治”的中醫(yī)理論指導(dǎo)下,周端教授率先將參蛤散用于心力衰竭的治療,并取得好的臨床療效[4]?；A(chǔ)研究顯示,參蛤散有較好的抗氧化[11]、抗心肌纖維化[12]等作用,具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

在心力衰竭的研究中,干預(yù)血管生長(zhǎng)是一個(gè)重要方向。血管新生是指在受到組織缺氧或創(chuàng)傷等刺激時(shí),從已有的血管系統(tǒng)中形成新血管[13]。血管新生有助于心肌梗死后微循環(huán)的重建,通過(guò)促血管新生,抑制心肌重構(gòu)是防治心力衰竭的研究熱點(diǎn)[14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是研究較多的一種血管生成因子,在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15],該過(guò)程涉及諸多促血管生成因子,如血管生成素-1、血管生成素-2等[16]。通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路,VEGF和血管生成素-2在代償性心肌肥厚階段表達(dá)增加,繼而提高心肌組織內(nèi)毛細(xì)血管密度;心力衰竭代償期,阻斷VEGF生成時(shí),心肌組織內(nèi)毛細(xì)血管密度降低,心臟收縮功能下降,心功能提前進(jìn)入心臟的失代償期[17]。Friehs等[18]分析縮窄新生兔的主動(dòng)脈,建立心肌肥厚模型,采用外源性VEGF和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(GM6001)干預(yù)后,在心肌肥厚階段,外源性VEGF與其引起的MMP-2激活可促進(jìn)微血管生成,從而延緩心力衰竭進(jìn)程。Sano等[19]通過(guò)縮窄主動(dòng)脈,建立小鼠心力衰竭模型,結(jié)果顯示,血管生長(zhǎng)抑制劑(TNP-470)抑制了小鼠心肌肥厚,加速了心功能進(jìn)入失代償期,VEGF和血管生成素-1可改善心功能,延緩心功能進(jìn)入失代償期。

斑馬魚(yú)是一種較好的模型生物,廣泛應(yīng)用于生物、環(huán)境等各領(lǐng)域中。前期研究使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)人參水煎液不能促進(jìn)斑馬魚(yú)正常血管生長(zhǎng),但較低濃度時(shí)可抑制VRI誘導(dǎo)的血管損傷[10],但西洋參和紅參水煎液在斑馬魚(yú)正常血管生長(zhǎng)模型及VRI誘導(dǎo)的血管損傷模型中均可促進(jìn)斑馬魚(yú)血管生長(zhǎng)[20-21]。蛤蚧是參蛤散中的另一組成藥物,前期研究發(fā)現(xiàn),蛤蚧水煎液不能促進(jìn)斑馬魚(yú)的正常血管生長(zhǎng),但對(duì)VRI誘導(dǎo)損傷血管具有保護(hù)作用,且蛤蚧尾效果更好[22]。

本研究使用了參蛤散水煎液,將人參和蛤蚧配伍后進(jìn)行水煎液的配制,使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型。結(jié)果表明,參蛤散不能促進(jìn)斑馬魚(yú)的正常血管生長(zhǎng),但可抑制VRI對(duì)血管的損傷作用。若將人參換為紅參或西洋參,結(jié)果能否改變需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示,參蛤散可能通過(guò)上調(diào)VEGF發(fā)揮促進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用,而VEGF可能與PI3K/Akt通路密切相關(guān)。Zhou等[23]研究顯示,舒心飲可促進(jìn)斑馬魚(yú)血管新生,可能與VEGF/PI3K/Akt/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,參蛤散具有促血管生長(zhǎng)的作用,該作用可能是參蛤散抗心力衰竭的機(jī)制之一,具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。