張宜輝,曹菲菲,劉康軍,尹文兵,李建基,董俊升,崔璐瑩,孟 霞,朱國強,王 亨*

(1.揚州大學 獸醫(yī)學院 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009;2.教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇 揚州 225009;3.揚州大學 實驗農牧場,江蘇 高郵 225600)

奶牛乳腺炎主要由細菌感染造成,給全球乳制品行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。隨著我國規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展和牧場防控技術的不斷進步,環(huán)境性致病菌在乳腺炎致病菌中的比例逐漸升高[2]。肺炎克雷伯菌是一種常見的環(huán)境性致病菌,在我國規(guī)?；翀雠R床型乳腺炎中的分離率高達13%[3]。肺炎克雷伯菌感染常常造成嚴重的臨床型乳腺炎,有時會發(fā)展成慢性感染,造成產奶量下降[4]。目前,關于肺炎克雷伯菌誘導奶牛乳腺炎發(fā)病機制的研究較少。體外研究發(fā)現(xiàn),肺炎克雷伯菌能快速黏附并進入奶牛乳腺上皮細胞,造成細胞損傷、細胞凋亡和炎性反應[5]。

肺炎克雷伯菌體內感染模型的建立將有助于進一步探究該病的發(fā)病機制。使用奶牛建立乳腺炎模型受到多種限制,如成本過高、操作不便和飼養(yǎng)條件要求過高等[6]。與奶牛乳腺結構和功能有許多相似之處,小鼠乳腺不僅可以為病原微生物提供生存環(huán)境,還允許其與宿主細胞之間相互作用[7]。研究發(fā)現(xiàn),細菌載量、炎性細胞數(shù)量和組織病理學在小鼠乳腺炎模型中的變化和在奶牛乳腺炎中的變化相似[8]。因此,小鼠乳腺炎模型在奶牛乳腺炎相關的研究中被廣泛使用。通過建立小鼠乳腺炎模型揭示了多種病原微生物誘導乳腺炎的分子機制,如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌等[6]。利用小鼠乳腺炎模型可以初步評估潛在的抗菌藥物或免疫調節(jié)劑的治療效果,這為臨床乳腺炎的治療提供理論依據(jù)[9-10]。此外,轉基因或基因敲除小鼠的構建為研究特定基因對乳腺炎發(fā)病機制的影響提供便利[11]。相對于小鼠,使用大鼠建立乳腺炎模型操作更加方便,可以獲得更多的試驗樣本。因此,本試驗使用肺炎克雷伯菌臨床分離株建立大鼠乳腺炎模型探究肺炎克雷伯菌的致病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑中性樹脂和切片石蠟購自國藥集團化學試劑有限公司;蘇木素染液和伊紅染液購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol購自北京全式金生物有限公司;cDNA反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 主要儀器動物血球分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;超微量核酸蛋白測定儀和紫外分光光度計購自美國Thermo公司;熒光定量PCR儀購自美國BioRad公司;

1.3 肺炎克雷伯菌及培養(yǎng)肺炎克雷伯菌從奶牛乳腺炎乳汁中分離得到,該菌株為K1血清型,攜帶fimH、ureA、wcaG和uge等毒力基因。挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,在37℃搖床中培養(yǎng)18 h,取400 μL菌液轉接于LB液體培養(yǎng)基中,在37℃搖床中培養(yǎng)4.5 h使其達到對數(shù)生長期。取適量對數(shù)生長期的菌液,3 000 r/min離心15 min,用生理鹽水洗滌2次后,經(jīng)平板計數(shù)法計數(shù)后調整菌液濃度為1×109CFU/mL用于后續(xù)試驗。

1.4 大鼠乳腺炎模型的建立健康妊娠待產Wistar大鼠20只,體質量(275±25) g,由揚州大學比較醫(yī)學中心提供(實驗動物生產許可證:SCXK(蘇)2017-0007)。自配種成功后將母鼠隨機分成4組,分別是對照組和不同時間點(6,12,24 h)肺炎克雷伯菌感染組,每組5只。在大鼠分娩后4 d,經(jīng)乳頭導管在第4對乳腺中接種肺炎克雷伯菌,每側乳腺100 μL菌液(1×109CFU/mL),對照組接種等量生理鹽水。接種前2 h將母鼠與仔鼠分開,用異氟烷誘導母鼠全身麻醉,然后對第4對乳房皮膚常規(guī)剃毛和消毒。接種肺炎克雷伯菌后,大鼠單籠飼養(yǎng),自由采食、飲水。分別于注菌后6,12,24 h,采集外周血液用于血常規(guī)檢測;經(jīng)異氟烷誘導母鼠麻醉后,無菌采集乳腺組織,一部分乳腺組織保存于多聚甲醛中用于組織病理學檢查,一部分乳腺組織用于細菌載量測定,其余組織保存于液氮中。

1.5 乳腺組織細菌載量測定和細菌鑒定取相同解剖位置的乳腺組織,使用無菌玻璃勻漿器充分勻漿,將組織勻漿連續(xù)10倍梯度稀釋后接種在LB瓊脂平板上,在37℃下培養(yǎng),統(tǒng)計菌落數(shù)用于測定乳腺組織的細菌載量。通過PCR檢測khe基因(F:5′-TGATTGCATTCGCCACTGG-3′;R:5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′)鑒定從大鼠乳腺中分離出的細菌是否為肺炎克雷伯菌。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察和拍照,目的基因產物大小為428 bp。

1.6 乳腺病理組織學觀察乳腺組織在10%中性甲醛中固定72 h后,依次經(jīng)過脫水、透明、浸蠟和包埋后制作成石蠟切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和HE染色后,使用光學顯微鏡觀察組織病理學變化并拍照。

1.7 qRT-PCR法檢測乳腺組織中炎癥相關基因的mRNA表達水平按照TRIzol法提取乳腺組織總RNA,檢測RNA純度并調整其濃度。按照反轉錄試劑盒說明書的方法將RNA反轉錄成cDNA。根據(jù)參考文獻[12]中的方法檢測IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR4和 NOD2基因的mRNA表達水平。引物由北京擎科生物技術有限公司合成(表1)。

表1 目的基因引物序列

2 結果

2.1 臨床觀察和乳腺剖檢對照組大鼠精神良好,乳腺外觀正常,剖檢無可見病理變化(圖1A)。肺炎克雷伯菌感染后,大鼠精神沉郁,乳腺紅腫。剖檢發(fā)現(xiàn),在感染6 h時乳腺呈輕微暗紅色,水腫明顯(圖1B);感染12 h時乳腺腫脹嚴重,充血明顯(圖1C);感染24 h時乳腺呈暗紅色,局部有硬結,乳汁中有乳凝塊(圖1D)。

A.對照組;B.肺炎克雷伯菌感染6 h;C.肺炎克雷伯菌感染12 h;D.肺炎克雷伯菌感染24 h

2.2 乳腺組織病理學檢查對照組乳腺腺泡結構完整,上皮細胞排列整齊(圖2A);肺炎克雷伯菌感染后,腺泡結構被破壞,腺泡內及間質中出現(xiàn)大量的炎性細胞,上皮細胞脫落。隨著感染時間的延長,炎性細胞浸潤和上皮細胞的脫落增多(圖2B～D)。

A.對照組;B.肺炎克雷伯菌感染6 h;C.肺炎克雷伯菌感染12 h;D.肺炎克雷伯菌感染24 h;箭頭代表炎性細胞,星號代表脫落的上皮細胞

2.3 血常規(guī)檢查結果與對照組相比,肺炎克雷伯菌感染后外周血白細胞(WBC)、淋巴細胞(Lymph)和單核細胞(Mon)的數(shù)量極顯著降低(P<0.01);中性粒細胞(Gran)的數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

表2 大鼠外周血血常規(guī)變化 109/L

2.4 乳腺組織細菌載量測定肺炎克雷伯菌感染6 h時,乳腺組織的載菌量為1.8×107CFU/g;感染12 h時,乳腺組織的載菌量為5.5×107CFU/g;感染24 h時,乳腺組織的載菌量為2.4×108CFU/g。與感染6 h相比,組織載菌量在感染12 h沒有顯著性增加;與12 h相比,組織載菌量在感染24 h時極顯著升高(P<0.01)(圖3A)。對照組乳腺組織中無細菌生長,從乳腺組織中分離的細菌經(jīng)PCR鑒定均為肺炎克雷伯菌(圖3B)。

2.5 乳腺組織炎癥相關基因mRNA表達水平檢測如圖4所示,與對照組相比,乳腺組織中IL-1β 的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染6 h時顯著升高(P<0.05),感染12 h時極顯著升高(P<0.01),感染24 h時顯著升高(P<0.05)。IL-6的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染6和12 h時極顯著升高(P<0.01),感染24 h時顯著升高(P<0.05)。IL-8和TNF-α的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染6,12和24 h時極顯著升高(P<0.01)。TLR-4的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染6和12 h時極顯著升高(P<0.01),而在感染24 h時顯著下降(P<0.05)。NOD2的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染6和12 h時極顯著升高(P<0.01),感染24 h時顯著升高(P<0.05)。

3 討論

奶牛乳腺炎給乳制品業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,肺炎克雷伯菌是引起奶牛乳腺炎的重要病原菌之一[5]。目前,關于肺炎克雷伯菌誘導奶牛乳腺炎的分子機制研究較少。江孝俊等[13]通過乳頭導管注射100 μL濃度為1×109CFU/mL的肺炎克雷伯菌,構建了肺炎克雷伯菌小鼠乳腺炎模型。在本研究中,通過乳頭導管接種相同劑量的肺炎克雷伯菌,大鼠乳腺腫脹并伴隨明顯的病理損傷和炎性細胞浸潤,而對照組大鼠乳腺正常。以上結果表明,通過乳頭管接種肺炎克雷伯菌成功構建大鼠乳腺炎模型。

正常情況下,大鼠乳腺中吞噬細胞的數(shù)量較少[7]。當病原微生物感染時,乳腺組織中炎性因子和介質的釋放增加,增強毛細血管通透性和血管內皮細胞黏附分子的表達,從而有利于白細胞的黏附及向感染部位遷移[14]。肺炎克雷伯菌感染后,大鼠乳腺腺泡內及間質中出現(xiàn)大量的炎性細胞,這是導致外周血白細胞數(shù)量下降的原因之一。革蘭陰性菌在乳腺中增殖的速度和釋放毒素的能力與奶牛乳腺炎嚴重程度密切相關[15]。在肺炎克雷伯菌感染12 h 后,大鼠乳腺組織細菌載量開始快速增加。同時,組織剖檢和病理學結果表明乳腺組織隨著感染時間的延長損傷更加嚴重,說明肺炎克雷伯菌能適應乳腺微環(huán)境并大量增殖,從而造成乳腺組織損傷。因此,抑制肺炎克雷伯菌在乳腺內的增殖對治療肺炎克雷伯菌性乳腺炎至關重要。

炎癥因子是多效應蛋白,能夠誘導急性期蛋白的產生、增加血管通透性和促進白細胞向感染部位遷移,在抵抗病原微生物感染時具有重要的作用[16]。研究表明,炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-8的濃度在肺炎克雷伯菌感染的奶牛乳汁中升高[17]。肺炎克雷伯菌感染能誘導奶牛乳腺上皮細胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表達水平和蛋白水平升高[5]。不同炎癥因子之間發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用,構成復雜的免疫調節(jié)網(wǎng)絡參與炎癥反應[18]。IL-1β通過刺激特定的細胞表面受體(IL-1 Ⅰ型受體)發(fā)揮強大的促炎作用[19]。IL-1β和TNF-α通過直接或間接調節(jié)中性粒細胞和單核細胞的功能,促進這些細胞產生細胞因子加速炎癥反應[20]。在發(fā)生感染和組織損傷時IL-6迅速而短暫地產生,通過刺激急性期反應、造血和免疫反應促進宿主防御[21]。在本研究中,大鼠乳腺組織中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8基因的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染后顯著升高,表明炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8在肺炎克雷伯菌誘導的炎癥反應中具有重要的作用。

模式識別受體是先天免疫的重要組成部分,通過識別病原體相關分子模式啟動免疫應答抵抗病原微生物感染[22]。TLR4是Toll樣受體家族的一員,主要識別革蘭陰性菌的脂多糖[23]。本研究中,肺炎克雷伯菌感染后TLR4的mRNA表達水平在6和12 h顯著升高,但在24 h時顯著下降。在肺炎克雷伯菌感染的奶牛乳腺上皮細胞中,TLR4的mRNA表達水平在2～8 h內顯著升高[24]。小鼠乳腺炎模型中,TLR4的mRNA表達水平在肺炎克雷伯菌感染后1～4 d內均未發(fā)生顯著性變化[13]。因此,TLR4可能在肺炎克雷伯菌感染的早期發(fā)揮作用。NOD2是Nod樣受體家族的重要成員之一,能夠識別革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的胞壁酰二肽[25]。在識別胞內配體后,NOD2與受體蛋白RIP2相互作用激活NF-κB信號通路,誘導炎性基因的表達[26]。轉錄組學分析發(fā)現(xiàn),在肺炎克雷伯菌感染的巨噬細胞中NOD2的基因表達上調[27]。本研究中,肺炎克雷伯菌感染后,大鼠乳腺組織中NOD2基因的mRNA相對表達水平顯著升高。以上結果表明,TLR4和NOD2在大鼠乳腺抵抗肺炎克雷伯菌感染時發(fā)揮重要的作用。