劉永杰，石冬梅，代良，張帆，王國平

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）技術(shù)是指將女性卵子取出，在體外受精發(fā)育形成胚胎，再將胚胎移植回宮腔。IVF 過程中，在每個(gè)卵子周圍加入5 萬～10 萬條精子，以保障卵子能夠受精，即足量有活力的精子和成熟的卵子是受精成功的關(guān)鍵［1］。若IVF 取卵當(dāng)日出現(xiàn)單次所取的精子質(zhì)量下降，只能轉(zhuǎn)為卵泡漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），增加了配子體外操作過程，導(dǎo)致費(fèi)用和子代表觀遺傳學(xué)異常風(fēng)險(xiǎn)增加［2］。為提升精子質(zhì)量和改善患者取精狀態(tài)，多數(shù)患者依靠藥物以保證取卵日的精子質(zhì)量。然而，取卵日的突發(fā)精子質(zhì)量下降這一問題仍無法避免。若男性可在短時(shí)間二次取精，可將短時(shí)間兩次精液中有活力的精子合并使用，就有機(jī)會(huì)獲得足夠有活力的精子，避免IVF轉(zhuǎn)為ICSI，減少人為干預(yù)，從而提高出生人口質(zhì)量［3］。然而，健康男性短時(shí)間內(nèi)兩次取精精液質(zhì)量的相關(guān)研究較少。Barbagallo 等［4］薈萃分析19 項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，少弱精子癥患者4 h 內(nèi)第2 次所取精液較第1 次精液的精子濃度顯著增加，而精子DNA 完整性卻顯著降低。為探究短時(shí)二次取精的價(jià)值，本研究選取我院健康體檢男性，分析在短時(shí)間內(nèi)取精前后兩次精液的質(zhì)量狀況和精子動(dòng)態(tài)參數(shù)，為助孕提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2022年7—8月就診于銀川市婦幼保健院生殖中心男科門診的48例健康體檢男性，經(jīng)超聲檢查雙側(cè)睪丸、附睪、精索未見異常，否認(rèn)肝炎、結(jié)核、腮腺炎等系統(tǒng)性疾病史，否認(rèn)放射線和化學(xué)物品接觸史，無泌尿生殖系統(tǒng)感染、畸形和精索靜脈曲張。年齡25～35歲，平均（28.94±3.62）歲。本研究已通過銀川市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（市婦幼倫理第2021-50），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 精液分析 研究對(duì)象禁欲2～7 d，在院內(nèi)取精室手淫取精液，在第1 次取精后1 h，再次手淫取精液。精液置于無菌杯中，36 ℃溫箱30～60 min液化。采用電子天平稱取精液質(zhì)量，精液液化后，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（北京，清華同方MX7.8.5-T）分析精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例、直線運(yùn)動(dòng)精子比例。精子動(dòng)態(tài)參數(shù)：平均曲線運(yùn)動(dòng)速度（curvilinear velocity，VCL）、平均直線運(yùn)動(dòng)速度（straight-line velocity，VSL）、平均路徑運(yùn)動(dòng)速度（average path velocity，VAP）、精子平均側(cè)擺幅值（amplitude of lateral head displacement，ALH）、精子平均鞭打頻率（beat-cross frequency，BCF）、精子平均移動(dòng)角度（mean angular displacement，MAD）、運(yùn)動(dòng)的直線性（linearity，LIN）、運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性（wobble，WOB）、運(yùn)動(dòng)的前向性（straightness，STR）。

1.3 精漿鋅、果糖、α-葡萄糖苷酶含量檢測(cè) 液化的精液動(dòng)態(tài)分析后900 r/min離心10 min，留取上層精漿待測(cè)。精漿鋅含量采用2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙基氨）-苯酚（5-Br-PAPS）法檢測(cè)，精漿果糖含量采用己糖激酶法檢測(cè)，精漿α-葡萄糖苷酶含量采用改良Cooper法檢測(cè)，所有試劑均購自深圳市博瑞德生物科技有限公司，檢測(cè)嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，2 組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩次取精精液各指標(biāo)變化 第1次取精的精液量、直線運(yùn)動(dòng)精子比例、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)、直線運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)、VCL、VAP、BCF、精漿鋅和α-葡萄糖苷酶水平均高于第2 次取精精液（P＜0.05）；兩次精液的精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例、VSL、ALH、MAD、LIN、WOB、STR和精漿果糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of seminal fluid indexes between two times of sperm extraction表1 2次取精精液各指標(biāo)的比較（n=48）

2.2 精液量與精子各動(dòng)態(tài)參數(shù)的關(guān)系 第1次取精的精液量與BCF 呈正相關(guān)（P＜0.05），第2 次取精的精液量與VCL、VSL、VAP、ALH、MAD、WOB 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Correlation between semen volume and sperm dynamic parameters at different extraction times表2 2次取精的精液量與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

2.3 精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子比例與精子各動(dòng)態(tài)參數(shù)的關(guān)系 總體的精子濃度與ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR 呈正相關(guān)（P＜0.05）；第1 次取精的精子濃度與BCF 呈正相關(guān)，第2 次取精的精子濃度與所有精子的動(dòng)態(tài)參數(shù)均呈正相關(guān)（P＜0.05），見表3。除第1次取精的BCF外，總體、第1次及第2次取精前向運(yùn)動(dòng)精子比例與其余精子的動(dòng)態(tài)參數(shù)均呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

Tab.3 Correlation between sperm concentration and sperm dynamic parameters at different extraction times表3 2次取精的精子濃度與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

Tab.4 Correlation between the proportion of forward motile sperm and sperm dynamic parameters at different extraction times表4 2次取精的向前運(yùn)動(dòng)精子比例與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

2.4 精漿鋅、果糖、α-葡萄糖苷酶水平與精子各動(dòng)態(tài)參數(shù)的關(guān)系 總體和第1 次精液的精漿鋅、精漿果糖及α-葡萄糖苷酶均與BCF 呈正相關(guān)（P＜0.05）；第2 次精液的精漿果糖與BCF 呈正相關(guān)（P＜0.05），精漿α-葡萄糖苷酶與VCL 和VAP 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表5—7。

Tab.5 Correlation between seminal plasma zinc and sperm dynamic parameters at different extraction times表5 2次取精的精漿鋅與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

Tab.6 Correlation between spermatodynamic parameters and spermatozoa saccharide at different extraction times表6 2次取精的精漿果糖與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

Tab.7 Correlation between glucosidase and sperm dynamic parameters at different extraction times表7 2次取精的精漿α-葡萄糖苷酶與精子動(dòng)態(tài)參數(shù)的相關(guān)性（rs）

3 討論

睪丸產(chǎn)生的精子經(jīng)附睪逐漸成熟后獲得運(yùn)動(dòng)能力，與此同時(shí)，因細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致一部分精子活動(dòng)力下降［5］；精子在附睪中存留時(shí)間越長(zhǎng)，精子質(zhì)量下降就越嚴(yán)重。WHO 建議禁欲2～7 d 行精液分析［6］。大量研究也證實(shí)禁欲2～7 d可以獲得最佳的精子［7-9］。Rosenkj?r 等［10-11］認(rèn)為短時(shí)二次所取的精液雖然精液量、精子濃度和精子總數(shù)明顯下降，但前向運(yùn)動(dòng)精子比例卻明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)二次所取精液的精液量、直線運(yùn)動(dòng)精子比例、精子總數(shù)等較第1 次精液降低，與既往研究一致［12］。而兩次精子濃度水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與研究對(duì)象均為正常人群有關(guān)。由于個(gè)人心理狀況導(dǎo)致每個(gè)人的取精狀態(tài)完全不同，正常人群更容易調(diào)節(jié)自身心理快速適應(yīng)環(huán)境，在任何禁欲時(shí)間內(nèi)取到精液的精子濃度波動(dòng)較?。?3］。

精子質(zhì)量是影響精卵結(jié)合的關(guān)鍵因素之一，其決定于精子的數(shù)量、運(yùn)動(dòng)能力、頂體反應(yīng)及核DNA完整情況。9項(xiàng)精子動(dòng)態(tài)參數(shù)中，VCL、VSL、VAP代表精子前進(jìn)的速度，ALH、MAD、WOB代表精子與卵子結(jié)合的方向、LIN、STR代表精子運(yùn)動(dòng)的方向，BCF代表精子前進(jìn)的動(dòng)能［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)第2次精液VCL、VAP、BCF 較第1 次精液降低，而兩次精液的VSL、ALH、MAD、LIN、WOB、STR 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測(cè)，第2 次所取精液中精子前進(jìn)的動(dòng)能和速度均較第1 次差，故可抵達(dá)卵子的精子數(shù)量會(huì)少，但由于精子運(yùn)動(dòng)的方向和與卵子結(jié)合的方向無差異，故可以抵達(dá)卵子的精子，其與卵子結(jié)合能力是一樣的。

精液中精囊腺液、前列腺液、附睪液分別約占60%、30%和8%。臨床上可通過測(cè)定精漿中果糖、鋅及α-葡萄糖苷酶的含量分別評(píng)估精囊腺、前列腺及附睪的功能狀態(tài)［16］。睪丸產(chǎn)生的無活動(dòng)能力精子只有在附睪中進(jìn)一步成熟才能獲得尾部鞭打和前向運(yùn)動(dòng)的能力，利用精囊腺的能量以及前列腺的活化作用形成有受精潛質(zhì)的精子［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，總體和第1 次取精精液量、精漿鋅和α-葡萄糖苷酶與BCF 呈正相關(guān)，且第2 次精液的精漿鋅和α-葡萄糖苷酶含量顯著低于第1 次；總體、第1 次及第2 次精液精漿果糖與BCF均呈正相關(guān)，但第1次和第2次精液果糖的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能因禁欲時(shí)間短，附睪和前列腺中促進(jìn)精子成熟的相關(guān)物質(zhì)未能完全分泌［18］，導(dǎo)致精子前向鞭打能力不能充分體現(xiàn)［19］，但精囊腺可以在短時(shí)間內(nèi)分泌足夠精子所需能量物質(zhì)，所以第2 次精液中尚存在一定數(shù)量有受精能力的精子。由于實(shí)驗(yàn)室中精子和卵子結(jié)合使用的受精液中有大量保護(hù)精子的成份，因此建議在行IVF 助孕時(shí)，取卵日二次所取精液應(yīng)該立即將精子從精漿中分離出來，并加入受精液中予以保護(hù)，以避免精漿成分不完整造成對(duì)精子的影響［18，20-21］。

綜上所述，雖然短時(shí)第2 次所取精液中精子整體的運(yùn)動(dòng)能力較第1 次明顯下降，但并不影響活動(dòng)精子與卵子的結(jié)合能力，可以作為IVF的有效補(bǔ)充。