孫立燕，劉澤茹，蘇永勝，艾宏亮

膿毒癥是以持續(xù)的過度炎癥為主要特征的綜合征，大多由病原體入侵、感染引起，機體因免疫應答失調(diào)誘發(fā)全身炎癥反應，導致多器官功能障礙，通常肺是最先受累的器官，可發(fā)生急性肺損傷及肺功能障礙，威脅患者生命安全［1-2］。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，為一種新型程序性細胞死亡方式，在膿毒癥引發(fā)的肺損傷中發(fā)揮重要作用，可導致肺泡上皮細胞嚴重受損和死亡，損害正常肺功能，因此抑制細胞焦亡是減輕膿毒癥誘發(fā)肺損傷的有效策略［3-4］。研究顯示，細胞焦亡由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）/胱天蛋白酶1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）信號通路介導，抑制該通路激活可顯著降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導的血管內(nèi)皮細胞的焦亡和炎癥反應［5］，降低NLRP3 表達水平可通過抑制細胞焦亡而緩解膿毒癥誘導的急性肺損傷［6］。車葉草苷是廣泛分布在茜草科、杜仲科等植物中的環(huán)烯醚萜類化合物，具有明顯的抗炎和抗氧化活性［7-8］。茜草科植物巴戟天為具有補腎益肺功效的一味藥材，對慢性阻塞性肺疾病具有治療作用［9］。因而，筆者推測車葉草苷可能對膿毒癥引發(fā)的肺損傷有治療作用。本研究通過構(gòu)建膿毒癥肺損傷大鼠模型，探討車葉草苷調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路對其肺組織細胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，7 周齡左右，體質(zhì)量200～230 g，在濰坊醫(yī)學院動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（魯）2019-0016］適應性飼養(yǎng)1 周，動物房內(nèi)保持屏障環(huán)境，分籠喂養(yǎng)，每籠不超過4只，操作遵循3R原則并嚴格遵循《中華人民共和國實驗動物管理條例》。NLRP3 激活劑尼日利亞霉素購自美國MCE公司；脂多糖（LPS，純度≥99%）、車葉草苷（純度≥98%，實驗時以生理鹽水溶解至所需濃度）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、大鼠白細胞介素（IL）-8酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、瑞氏-姬姆薩復合染液購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠IL-6、IL-1β ELISA試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、兔源抗大鼠NLRP3一抗、免疫熒光染色試劑盒-抗山羊Cy3、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 488、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源抗大鼠GAPDH 一抗、兔源抗大鼠caspase-1 一抗、兔源抗大鼠GSDMD 一抗購自英國Abcam 公司；兔源抗大鼠GSDMD 一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；山羊源抗大鼠NLRP3一抗購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司等。

1.2 研究方法

1.2.1 膿毒癥肺損傷大鼠模型制備及分組處理 取SD大鼠50只，腹腔內(nèi)注射0.5 mL/kg的LPS溶液（藥物含量10 g/L），建立膿毒癥肺損傷模型［10］。大鼠出現(xiàn)食欲明顯減退、活動減少、口鼻分泌物增多且產(chǎn)生呼吸窘迫癥狀時為造模成功。將造模成功的50只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型（M）組、車葉草苷低劑量（AL）組、車葉草苷中劑量（AM）組、車葉草苷高劑量（AH）組、車葉草苷高劑量+尼日利亞霉素（AH+N）組，每組10只；另取10只SD大鼠腹腔注射0.5 mL/kg劑量的生理鹽水作為對照（C）組。AL組、AM組和AH組分別灌胃17.5、35、70 mg/kg［11］的車葉草苷，AH+N組在AH組的基礎上腹腔注射1 mg/kg［12］的尼日利亞霉素。M 組和C 組灌胃10 mL/kg 的生理鹽水，各組大鼠每天給藥1次，共持續(xù)給藥14 d。

1.2.2 大鼠肺功能、動脈血氧分壓［p（O2）］檢測 分組處理結(jié)束后24 h，采用小動物全身無創(chuàng)肺功能儀檢測各組大鼠肺功能：每分鐘通氣量（MV）與吸氣阻力（Ri）。以乙醚麻醉各組大鼠，取頸動脈血約0.8 mL，置于血氣分析儀中測定p（O2），再次取頸動脈血約1.2 mL，3 000 r/min 離心5 min，取出上清液并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。通過頸椎脫臼處死大鼠，開胸后暴露游離支氣管，將右主支氣管結(jié)扎后切下右肺，將注射器針頭插入左主支氣管并結(jié)扎固定。以注射器抽取0.5 mL 無菌生理鹽水灌洗左肺直至其膨起并變白，輕柔按摩后回吸灌洗液，再次注入左肺，輕柔按摩、回吸，重復3次后收集灌洗液，3 000 r/min 離心5 min 取上清液即支氣管肺泡灌洗液（BALF），-80 ℃保存?zhèn)溆茫Ｓ嗉毎恋硪?00μL磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后備用。取0.5 g右肺組織保存在液氮中，剩余右肺組織放入凍存盒中包埋，液氮速凍后取出放入冷凍切片機中切片備用。

1.2.3 HE染色檢測肺組織病理形態(tài) 取1.2.2中右肺冰凍切片、復溫后浸入冰丙酮中固定，二甲苯透明后采用HE染色試劑盒進行染色，洗滌后在顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)并收集其圖片。

1.2.4 瑞氏-姬姆薩染色檢測BALF中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞數(shù) 取出1.2.2中收集BALF后剩余的細胞，采用細胞計數(shù)板測定細胞密度后，取約1.5×105個細胞懸浮液以瑞氏-姬姆薩復合染液孵育染色，滴入細胞計數(shù)板并在100 倍顯微鏡下隨機讀取5個視野分別計數(shù)中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞數(shù)量。

1.2.5 ELISA 檢測血清炎性細胞因子 取1.2.2 中收集的各組大鼠血清，放入冰水浴中解凍，參照說明書，采用ELISA試劑盒測定其中炎性細胞因子IL-6、IL-8及IL-1β水平。

1.2.6 免疫熒光染色法檢測肺組織細胞焦亡相關蛋白表達 取1.2.2 中收集的各組大鼠右肺冰凍切片，每只大鼠3張，復溫后浸入冰丙酮中固定，二甲苯透明、孵育3%過氧化氫、3%脫脂奶粉、孵育山羊源抗大鼠NLRP3一抗和兔源抗大鼠GSDMD一抗（均1∶200），洗滌后孵育抗山羊Cy3二抗和抗兔Alexa Fluor 488二抗（均1∶500），并參照其試劑盒說明進行免疫熒光染色，洗滌后在熒光顯微鏡激發(fā)光下觀察大鼠肺組織GSDMD與NLRP3共表達情況并采集其圖像，用Image J軟件計算相對熒光強度(即實驗組熒光強度/對照組熒光強度)。

1.2.7 Western blot 法檢測肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路相關蛋白表達 取1.2.2中收集的各組大鼠右肺組織塊，剪碎后加入RIPA 裂解液研磨勻漿后提取總蛋白。以BCA 蛋白濃度測定試劑盒測出其濃度后每組取出20 μg，100 ℃煮沸變性、120 V恒壓電泳、40 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)后，于硝酸纖維素膜上得到分離的總蛋白。以脫脂牛奶封閉后，剪下NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GAPDH這4種蛋白條帶，兔源抗大鼠NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GAPDH 一抗（均1∶2 000）、HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）孵育，洗滌后掃描采集各組大鼠上述4種蛋白條帶圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，Image J軟件進行量化分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺功能指標與p（O2）比較 與C組比較，M組MV、p（O2）降低，Ri 升高（P＜0.05）；與M 組比較，AL、AM及AH組大鼠MV、p（O2）依次升高，Ri依次降低（P＜0.05）；與AH 組比較，AH+N 組大鼠MV、p（O2）降低，Ri升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of lung function indexes and p(O2)of rats between the six groups表1 各組大鼠肺功能指標與p（O2）比較（n=10，）

Tab.1 Comparison of lung function indexes and p(O2)of rats between the six groups表1 各組大鼠肺功能指標與p（O2）比較（n=10，）

＊＊P＜0.01；1 mmHg=0.133 kPa；a與C組比較，b與M組比較，c與AL組比較，d與AM組比較，e與AH組比較，P＜0.05。

組別C組M組AL組AM組AH組AH+N組F MV（mL）7.69±0.86 2.71±0.42a 3.91±0.48b 4.80±0.51bc 7.13±0.73bcd 2.93±0.38e 129.083＊＊Ri（kPa-1·L-1·s-1）24.97±4.65 59.68±6.80a 50.98±6.12b 42.24±5.16bc 26.43±4.52bcd 55.32±6.03e 69.525＊＊p（O2）（mmHg）98.82±10.61 54.75±5.15a 65.12±6.24b 75.82±7.43bc 95.93±9.52bcd 58.12±5.36e 61.205＊＊

2.2 各組肺組織病理形態(tài)變化 C組大鼠肺組織形態(tài)完好；M 組肺組織內(nèi)有彌漫性出血及炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺間隔斷裂，肺泡變形塌陷且肺泡壁增厚，肺組織整體呈現(xiàn)嚴重病理損傷癥狀；與M組比較，車葉草苷各劑量組大鼠肺組織病理損傷癥狀均減輕，且AH 組大鼠肺組織病理損傷癥狀減輕程度更大；與AH 組比較，AH+N 組大鼠肺組織病理損傷癥狀加重，見圖1。

Fig.1 Pathological morphology of rat lung tissue detected by HE staining(×200)圖1 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理形態(tài)（×200）

2.3 各組大鼠BALF中炎性細胞數(shù)量比較 與C組比較，M組中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞數(shù)均升高（P＜0.05）；與M 組比較，AL、AM 及AH 組大鼠中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞數(shù)均依次降低（P＜0.05）；與AH 組比較，AH+N 組大鼠中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞數(shù)均升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the six groups表2 各組大鼠BALF中炎性細胞數(shù)比較（n=10，×106/mL，）

Tab.2 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the six groups表2 各組大鼠BALF中炎性細胞數(shù)比較（n=10，×106/mL，）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與M 組比較，c與AL 組比較，d與AM 組比較，e與AH組比較，P＜0.05。

組別C組M組AL組AM組AH組AH+N組F中性粒細胞2.68±0.65 13.10±1.12a 10.68±0.95b 8.19±0.70bc 3.15±0.57bcd 12.38±1.31e 242.906＊＊巨噬細胞22.76±2.43 54.20±6.51a 46.59±5.27b 39.84±4.25bc 25.90±2.56bcd 53.32±6.03e 80.336＊＊淋巴細胞5.09±0.67 81.94±17.62a 64.75±13.41b 45.01±9.46bc 6.13±0.81bcd 80.61±15.73e 88.312＊＊

2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 與C 組比較，M 組血清IL-6、IL-8 及IL-1β 水平均升高（P＜0.05）；與M組比較，AL、AM及AH組大鼠血清IL-6、IL-8 及IL-1β 水平均依次降低（P＜0.05）；與AH 組比較，AH+N 組大鼠血清IL-6、IL-8 及IL-1β 水平均升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-6,IL-8 and IL-1β between the six groups表3 各組大鼠血清IL-6、IL-8及IL-1β水平比較（n=10，ng/L，）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-6,IL-8 and IL-1β between the six groups表3 各組大鼠血清IL-6、IL-8及IL-1β水平比較（n=10，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與M 組比較，c與AL 組比較，d與AM 組比較，e與AH組比較，P＜0.05。

組別C組M組AL組AM組AH組AH+N組F TNF-α 27.35±5.02 183.46±21.53a 136.59±17.84b 107.86±13.46bc 31.12±6.32bcd 164.63±20.14e 185.239＊＊IL-8 204.94±32.25 968.40±92.30a 761.25±77.62b 589.32±54.92bc 229.86±30.74bcd 960.11±90.58e 251.860＊＊IL-1β 16.87±3.03 242.64±28.12a 193.45±20.51b 134.45±12.51bc 21.13±3.54bcd 230.36±25.92e 296.171＊＊

2.5 各組大鼠肺組織細胞焦亡情況 M 組肺組織產(chǎn)生嚴重肺組織細胞焦亡，NLRP3 和GSDMD 共表達于肺泡上皮細胞，且與C組比較，M組大鼠肺組織NLRP3 和GSDMD 相對熒光強度均升高（P＜0.05）；與M 組比較，AL、AM 及AH 組大鼠肺組織NLRP3 和GSDMD相對熒光強度均依次降低（P＜0.05）；與AH組比較，AH+N組大鼠肺組織NLRP3和GSDMD相對熒光強度均升高（P＜0.05），見表4、圖2。

Fig.2 Co-expression of NLRP3 and GSDMD in rat lung tissue detected by immunofluorescence staining(×200)圖2 免疫熒光染色檢測各組大鼠肺組織NLRP3和GSDMD共表達情況（×200）

Tab.4 Comparison of relative fluorescence intensity of NLRP3 and GSDMD in lung tissue of rats between the six groups表4 各組大鼠肺組織NLRP3和GSDMD相對熒光強度比較（）

Tab.4 Comparison of relative fluorescence intensity of NLRP3 and GSDMD in lung tissue of rats between the six groups表4 各組大鼠肺組織NLRP3和GSDMD相對熒光強度比較（）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與M 組比較，c與AL 組比較，d與AM 組比較，e與AH組比較，P＜0.05。

組別C組M組AL組AM組AH組AH+N組F n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 1.00±0.00 2.89±0.36a 2.36±0.29b 2.02±0.25bc 1.16±0.20bcd 2.64±0.34e 84.386＊＊GSDMD 1.00±0.00 2.57±0.32a 2.19±0.26b 1.84±0.29bc 1.13±0.17bcd 2.31±0.33e 63.873＊＊

2.6 各組大鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路相關蛋白表達水平比較 與C 組比較，M 組肺組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達升高（P＜0.05）；與M 組比較，AL、AM 及AH 組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達依次降低（P＜0.05）；與AH 組比較，AH+N 組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達均升高（P＜0.05），見圖3、表5。

Fig.3 The expression of NLRP3/Caspase-1/GSDMD signaling pathway related proteins in lung tissue of each group detected by Western blot assay圖3 Wester blott檢測各組大鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路相關蛋白表達

Tab.5 Comparison of relative expression levels of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway related proteins in lung tissue of rats between the six groups表5 各組大鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關蛋白相對表達水平比較（）

Tab.5 Comparison of relative expression levels of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway related proteins in lung tissue of rats between the six groups表5 各組大鼠肺組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關蛋白相對表達水平比較（）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與M 組比較，c與AL 組比較，d與AM 組比較，e與AH組比較，P＜0.05。

組別C組M組AL組AM組AH組AH+N組F n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 0.19±0.04 1.20±0.16a 0.98±0.13b 0.71±0.10bc 0.22±0.05bcd 1.16±0.11e 178.049＊＊Caspase-1 0.10±0.02 1.08±0.13a 0.81±0.11b 0.59±0.07bc 0.13±0.03bcd 1.04±0.14e 204.821＊＊GSDMD 0.21±0.04 1.29±0.15a 0.95±0.12b 0.78±0.09bc 0.25±0.06bcd 1.26±0.16e 178.037＊＊

3 討論

膿毒癥重癥率和病死率均較高，而膿毒癥相關肺損傷是造成患者死亡的主要原因，主要的治療方案是應用抗生素控制感染及生命體征支持治療，但并未從根本上解除患者死亡風險［13-14］。膿毒癥引發(fā)的各種炎癥介質(zhì)過量生成和釋放是急性肺損傷的主要致病因素，細胞焦亡在此過程中至關重要，通過減弱細胞焦亡可有效緩解膿毒癥相關肺損傷［15-16］。本研究結(jié)果顯示，與C組比較，M組肺組織內(nèi)有彌漫性出血及炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺間隔斷裂，肺泡變形塌陷且肺泡壁增厚，肺組織整體呈現(xiàn)嚴重病理損傷癥狀，細胞焦亡相關蛋白NLRP3 和GSDMD于肺泡上皮細胞共同高表達，并伴隨BALF 中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)以及血清IL-6、IL-8、IL-1β 水平升高，最終導致大鼠MV、p（O2）降低，Ri升高，肺功能嚴重受損，表明LPS可誘導大鼠炎癥反應和細胞焦亡的發(fā)生。

車葉草苷能降低肺癌荷瘤小鼠整體炎性反應并發(fā)揮抑瘤作用［11］。車葉草苷作為巴戟天的活性成分之一，還可對慢性阻塞性肺疾病起到治療功效［9］。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的車葉草苷均可減輕膿毒癥肺損傷大鼠肺組織病理損傷及肺組織細胞焦亡癥狀，并降低Ri，降低BALF中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)以及血清IL-6、IL-8、IL-1β 水平，抑制肺組織NLRP3 和GSDMD 表達，同時升高MV 和p（O2），且高劑量車葉草苷對上述指標的作用效果更好，表明車葉草苷尤其是高劑量車葉草苷可降低炎性細胞因子合成釋放，抑制膿毒癥引發(fā)的肺組織炎性損傷，緩解肺組織細胞焦亡，修復大鼠肺功能，提示車葉草苷可通過減輕細胞焦亡來治療膿毒癥相關肺損傷。

細胞焦亡是一種依賴于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路的新型程序性細胞死亡形式，與抑郁癥、膿毒癥、急性肺損傷等多種炎性疾病發(fā)病有關，通過抑制NLRP3介導的Caspase-1激活，可減少促炎細胞因子產(chǎn)生和脾的樹突狀細胞焦亡，最終降低膿毒癥小鼠病死率［17］。抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD 介導的細胞焦亡可緩解抑郁癥發(fā)病機制中的星形膠質(zhì)細胞丟失［18］，還可減輕膿毒癥誘導的肺組織炎性細胞浸潤及肺損傷［19］。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的車葉草苷均可降低膿毒癥肺損傷模型大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達，且高劑量車葉草苷對NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達的降低作用更好，提示NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路參與介導車葉草苷對膿毒癥大鼠肺組織細胞焦亡的抑制過程。以NLRP3 激活劑尼日利亞霉素和車葉草苷聯(lián)合處理膿毒癥肺損傷模型大鼠后發(fā)現(xiàn)，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達上調(diào)，大鼠肺組織病理損傷及肺組織細胞焦亡癥狀加重，大鼠Ri 降低，BALF 中性粒細胞和巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)下降，血清IL-6、IL-8 及IL-1β 水平減少，肺組織NLRP3、GSDMD相對熒光強度升高，MV、p（O2）降低，表明尼日利亞霉素可減弱車葉草苷對膿毒癥大鼠肺組織炎癥和肺組織細胞焦亡的抑制作用，逆轉(zhuǎn)其對大鼠肺功能的修復功效，提示車葉草苷抑制膿毒癥大鼠肺組織細胞焦亡是通過下調(diào)NLRP3通路活性而實現(xiàn)的。

綜上所述，車葉草苷可通過下調(diào)NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關蛋白活性來降低炎性細胞因子釋放水平，從而阻止膿毒癥引發(fā)的大鼠體內(nèi)炎癥發(fā)生、發(fā)展，減輕大鼠肺組織炎性損傷，減少肺組織細胞焦亡，最終改善肺功能。車葉草苷有助于降低膿毒癥患者重癥率及病死率。然而，本研究未闡明車葉草苷與尿毒癥大鼠氧化應激反應之間的關系，是否有其他通路參與車葉草苷改善尿毒癥大鼠肺損傷這一過程也尚不明確，未來將針對這些不足之處開展實驗，繼續(xù)探究車葉草苷的具體調(diào)節(jié)機制。