周夢竹，張海鳳，張雪，張躍，程立君，劉彤，劉長樂

目前糖尿病（DM）的患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升，預(yù)計到2045 年將有6.93 億人受到影響，相比2017 年受影響人數(shù)增加50%。在高血糖應(yīng)激狀態(tài)下，心肌細胞的穩(wěn)態(tài)被打破，從而促進心肌病的發(fā)展［1-2］。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）促使心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，在高血糖條件下，炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和鈣穩(wěn)態(tài)失衡的相互作用促進心室重構(gòu)的進展，也是心肌肥厚和心肌纖維化的復(fù)雜病理過程［3］。早期心室重構(gòu)以適應(yīng)內(nèi)環(huán)境變化，但隨著時間的推移心室重構(gòu)的失調(diào)導(dǎo)致心功能下降［3-4］。格列本脲（glibenclamide，GLB）是一種磺酰脲類降糖藥，同時也是核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體的特異性抑制劑，不僅具有降糖作用，也可抑制炎癥反應(yīng)，減少組織纖維化［5-6］。但鮮見GLB與ERS和氧化應(yīng)激的相關(guān)研究。本研究旨在探索NLRP3 激活ERS 和促進氧化應(yīng)激是否參與DM 大鼠心室重構(gòu)以及GLB 能否改善此變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素、檸檬酸鈉緩沖液、HE染色試劑盒和Masson 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；GLB（2.5 mg×100 片）購自天津太平洋制藥有限公司；二氫乙錠（DHE）購自美國US EVERBRIGHT 公司；血糖試紙條、血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司；PVDF膜購自德國GE Healthcare 公司；雙辛酸（BCA）蛋白測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；兔抗NLRP3抗體購自美國NOVUSBIO公司；兔抗鼠胱天蛋白酶-1（caspase-1）多克隆抗體購自美國Proteintech 公司；兔抗鼠肌醇需求激酶-1α（inositol-requiring protein-1α，IRE-1α）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）抗體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH-oxidase 2，NOX2）抗體和NOX4 抗體均購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自美國Promega 公司；小動物心臟彩色超聲儀購自美國Visual Sonics 公司；無創(chuàng)血壓計購自Softron biotechnology 公司；心外膜激活映射標測系統(tǒng)購自英國Mapping Lab 公司；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自上海Tanon科技股份有限公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；TP1020全自動生物組織脫水機、病理石蠟切片機、石蠟切片展片機、病理組織烤片機、冰凍切片機購自德國Leica公司；生物組織包埋機（BMJ-1）購自上海珂淮有限公司。

1.2 實驗動物及分組 36 只6 周齡健康雄性Sprague-Dawley 大鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量200～220 g，按隨機數(shù)字表法分為對照組（CTL組）、糖尿病組（DM 組）和糖尿病+GLB 組（GLB 組），每組12 只。每組按隨機數(shù)字表法抽取6只大鼠進行超聲心動圖檢測、血流動力學(xué)實驗、組織病理學(xué)檢查及蛋白免疫印跡分析，另外6只大鼠進行心外膜激活映射標測。DM 模型建立前大鼠禁食12 h，通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素（溶于枸櫞酸緩沖液）55 mg/kg進行建模，48 h 后，通過檢測尾靜脈血糖驗證DM 模型，單次空腹血糖≥14 mmol/L 或兩次空腹血糖≥11 mmol/L 為建模成功。GLB 組于造模成功后每日上午灌胃GLB 1.25 mg/kg，連續(xù)8周，CTL 組不進行任何干預(yù)。將3 組大鼠在相同溫度、濕度，通風(fēng)良好，水食物供應(yīng)充足喂養(yǎng)。8周后記錄各組血糖、血壓和體質(zhì)量。本實驗所有操作均經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)動物區(qū)域倫理委員會批準。

1.3 血流動力學(xué)指標測量 將大鼠置于安靜室內(nèi)，10 min后待大鼠穩(wěn)定并適應(yīng)環(huán)境，用網(wǎng)袋固定大鼠，并對尾巴進行加溫以擴張血管，待大鼠穩(wěn)定后測量心率、收縮壓、舒張壓。每只大鼠共測量5次，取平均值。

1.4 心臟超聲檢查 造模成功8 周后，用1.5%異氟醚麻醉大鼠并連接體表心電圖，用心臟彩色超聲儀進行檢查。分別從胸骨旁左心室長軸位、短軸位和心尖四腔切面評估肺動脈血流加速時間、平均肺動脈壓、收縮期與舒張期室間隔、心室前壁和心室后壁厚度。各測量3次，取平均值。

1.5 心外膜激活映射標測 造模成功8周后，大鼠麻醉后游離氣管并進行氣管插管，連接呼吸機后開胸行心外膜激活映射標測。將36個電極（6×6格）置于心臟表面，通過多通道矩陣電生理標測系統(tǒng)選取心室傳導(dǎo)均勻的心室波測量心室傳導(dǎo)速度，選取至少3 個連續(xù)心室波，計算心室心外膜傳導(dǎo)速度、心室絕對不均勻性及心室不均勻指數(shù)。所有結(jié)果均采用EMapScope 4.0軟件進行分析。

1.6 蛋白免疫印跡實驗檢測組織蛋白表達 造模成功8 周后，將大鼠麻醉處死，取心室組織，計算心室體質(zhì)量比。加入1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液提取心室組織蛋白。組織勻漿用12 000×g離心20 min，取上清液備用。采用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。樣品蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)移到0.45μm PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封片1 h 后，與特異性一抗，包括炎性相關(guān)蛋白NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶1 000），ERS相關(guān)蛋白CaMKⅡ（1∶1 000）、IRE-1α（1∶1 000），氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NOX2（1∶1 000）、NOX4（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。然后用含Tween-20 的Tris 鹽酸緩沖液（TBST）清洗PVDF 片，用與HRP 結(jié)合的二抗孵育1 h，TBST 再次漂洗，檢測蛋白?？乖贵w反應(yīng)采用多化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行可視化。采用Image J軟件進行半定量分析。

1.7 熒光染色法測定活性氧（ROS）含量 用10μmol/L DHE染色心室組織冷凍切片（厚度10μm），37 ℃加濕箱孵育切片30 min 后，用磷酸鹽緩沖液沖洗10 min，重復(fù)3 次，隨后立即用玻片封片，在相同條件下用熒光顯微鏡成像，并用Image J軟件分析圖像的平均灰度值以量化ROS水平。

1.8 HE 染色及Masson 染色觀察心室組織細胞形態(tài)和纖維化 心室組織樣品置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切成4～5μm切片。通過HE染色和改良Masson染色觀察細胞形態(tài)和纖維化區(qū)域。每個樣本取3個隨機區(qū)域觀察并分析心室膠原體積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。用Image J軟件分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.3.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組基線特征、血流動力學(xué)和超聲心動圖指標比較 與CTL 組相比，DM 組的血糖升高，心室體質(zhì)量比增大，收縮期和舒張期室間隔厚度、左心室前壁厚度增加，體質(zhì)量降低（P＜0.05）。與DM 組相比，GLB 組收縮期和舒張期室間隔厚度、左心室前壁厚度減低（P＜0.05）。3組間收縮壓、舒張壓、肺動脈血流加速時間、平均肺動脈壓、收縮期和舒張期左心室后壁厚度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3組基線特征、血流動力學(xué)和超聲心動圖指標比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3組基線特征、血流動力學(xué)和超聲心動圖指標比較（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與CTL組比較，b與DM組比較，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

組別CTL組DM組GLB組F血糖（mmol/L）7.67±1.32 27.72±5.73a 28.33±2.24a 62.870＊＊體質(zhì)量（g）424.20±33.97 233.20±65.85a 267.50±68.76a 18.260＊＊心室體質(zhì)量比（‰）2.93±0.17 3.35±0.25a 3.08±0.12 7.830＊＊收縮壓（mmHg）119.30±9.37 126.20±7.94 120.50±10.77 0.902舒張壓（mmHg）85.67±7.17 82.33±9.42 88.17±8.35 0.735心率（次/min）346.50±30.35 295.20±43.80 346.80±29.71 4.275＊肺動脈血流加速時間（ms）32.22±3.16 29.90±6.87 32.58±4.72 0.476組別CTL組DM組GLB組F平均肺動脈壓（mmHg）70.03±1.96 71.46±4.26 69.80±2.92 0.476收縮期室間隔厚度（mm）2.69±0.25 3.41±0.33a 2.62±0.26b 14.350＊＊舒張期室間隔厚度（mm）1.63±0.24 2.06±0.26a 1.54±0.22b 8.134＊＊收縮期左心室前壁厚度（mm）2.89±0.19 3.48±0.42a 2.24±0.32ab 22.140＊＊舒張期左心室前壁厚度（mm）1.76±0.06 2.39±0.36a 1.47±0.17b 24.910＊＊收縮期左心室后壁厚度（mm）2.73±0.42 3.00±0.52 2.64±0.41 1.039舒張期左心室后壁厚度（mm）1.96±0.25 2.11±0.45 1.71±0.39 1.785

2.2 心外膜激活映射標測結(jié)果比較 與CTL 組相比，DM組左、右心室心外膜傳導(dǎo)速度減慢，右心室不均勻指數(shù)增加（P＜0.05）。與DM組相比，GLB組左、右心室心外膜傳導(dǎo)速度增快，左心室絕對不均勻性和不均勻指數(shù)降低（P＜0.05）。見表2、圖1。

Fig.1 Epicardial activation mapping in the three groups圖1 3組心外膜激活映射圖像

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結(jié)果比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結(jié)果比較（n=6，）

組別CTL組DM組GLB組F左心室心外膜傳導(dǎo)速度（m/s）1.05±0.27 0.52±0.24a 1.08±0.29b 7.066＊＊左心室絕對不均勻性2.25±0.23 4.40±2.21 1.68±0.20b 6.230＊左心室不均勻指數(shù)1.66±0.19 2.56±0.89 1.49±0.20b 5.635＊組別CTL組DM組GLB組F右心室心外膜傳導(dǎo)速度（m/s）0.87±0.20 0.58±0.15a 1.09±0.16b 11.620＊＊右心室絕對不均勻性2.32±0.47 4.68±3.09 2.39±0.17 2.759右心室不均勻指數(shù)1.38±0.13 2.01±0.43a 1.65±0.35 4.620＊

2.3 各組炎癥、ERS和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平比較 與CTL 組比較，DM 組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與DM 組比較，GLB 組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表達水平下降（P＜0.05）。見表3、圖2。

Fig.2 Protein expression in ventricular tissue in the three groups圖2 3組心室組織蛋白表達情況

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表達水平比較（n=6，）

組別CTL組DM組GLB組F NLRP3 0.80±0.27 1.26±0.33a 0.81±0.18b 5.814＊caspase-1 0.41±0.19 0.81±0.10a 0.36±0.20b 12.320＊＊CaMKⅡ1.17±0.16 1.50±0.28a 1.12±0.07b 7.092＊＊組別CTL組DM組GLB組F IRE-1α 0.28±0.09 0.56±0.13a 0.34±0.10b 10.960＊＊NOX2 1.15±0.34 1.93±0.45a 1.25±0.25b 8.459＊＊NOX4 0.92±0.22 1.60±0.21a 0.92±0.21b 20.000＊＊

2.4 ROS 檢測結(jié)果 CTL 組、DM 組和GLB 組平均灰度值分別為349.4±221.6、1 353.0±590.0 和509.3±265.9，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.180，P＜0.01）。與CTL 組比較，DM 組平均灰度值增大，心室肌ROS產(chǎn)生增多（P＜0.01）。與DM 組比較，GLB 組平均灰度值減小，心室肌ROS產(chǎn)生減少（P＜0.01）。見圖3。

Fig.3 Production of ROS in ventricular tissue in the three groups(DHE staining,×100)圖3 3組心室組織ROS產(chǎn)生情況（DHE染色，×100）

2.5 組織病理學(xué)染色結(jié)果 與CTL 組比較，DM 組心室肌細胞排列紊亂，而GLB 組較DM 組紊亂程度改善，CTL組、DM組和GLB組CVF（%）分別為2.06±0.27、8.47±1.31 和3.72±0.63，3 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=91.860，P＜0.01）。與CTL組比較，DM組CVF升高（P＜0.05），心室肌纖維化程度加重；與DM 組比較，GLB 組CVF 降低（P＜0.05），心室肌纖維化程度減輕。見圖4。

Fig.4 Pathological staining results of ventricular muscle in the three groups圖4 3組間心室肌病理染色結(jié)果

3 討論

在DCM的發(fā)展過程中，代謝紊亂會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，促進心臟重構(gòu)、纖維化和功能障礙。心室重構(gòu)主要包括電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)［3］。Zhan等［7］研究表明，DM 大鼠心外膜傳導(dǎo)速度降低，絕對不均勻性和不均勻指數(shù)增加。高血糖環(huán)境下，心臟復(fù)極時間延長，且離散程度和不均一性增加［8］。本研究通過心外膜激活映射標測評估電重構(gòu)，結(jié)果顯示DM組較CTL 組心室外膜傳導(dǎo)速度減慢，右心室不均勻指數(shù)增加，而GLB組較DM組心室外膜傳導(dǎo)速度、左心室絕對不均勻性及不均勻指數(shù)有所改善。心外膜心電傳導(dǎo)不均勻性升高，心電傳導(dǎo)方向離散程度增大，可能更容易導(dǎo)致心律失常。心肌肥大和纖維化是DCM 結(jié)構(gòu)重構(gòu)的代表性特征［9］。本研究通過心臟超聲和病理染色結(jié)果對心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)進行評估發(fā)現(xiàn)，與CTL 相比，DM 大鼠心室體質(zhì)量比、室間隔厚度、左心室前壁厚度增加，心室肌細胞排列紊亂，CVF升高，組織纖維化明顯；而GLB組較DM組室間隔和左心室前壁厚度有所改善，心肌細胞排列紊亂程度減輕，纖維化程度減輕，證實DM會對心臟產(chǎn)生不利影響，但這僅是DCM 發(fā)生的表觀現(xiàn)象，其分子機制尚不明確。

目前研究表明，DCM與炎癥、ERS和氧化應(yīng)激關(guān)系密切，三者共同促進DCM發(fā)生發(fā)展［10］。多種炎癥通路的活化在DCM中發(fā)揮重要作用，其中NLRP3炎性小體作為經(jīng)典的炎性因子被廣泛研究。NLRP3是一種常見的先天免疫信號受體，在炎癥性疾病的刺激和激活下，誘導(dǎo)多種類型細胞死亡［11-12］。NLRP3炎性小體的活化是一個連續(xù)的過程，首先需要觸發(fā)事件誘導(dǎo)NLRP3表達上調(diào)，之后NLRP3與含半胱天冬酶募集域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和caspase-l 組裝成具有酶活性的多蛋白復(fù)合物，激活下游經(jīng)典焦亡通路，進一步聚集炎性細胞，擴大炎癥反應(yīng)［13］。本課題組前期研究證實，NLRP3/caspase-1/Gal-3 信號通路參與調(diào)節(jié)DM兔模型的心房重構(gòu)［14］。GLB作為NLRP3 炎性小體抑制劑，具有抗炎和抗氧化特性［15-16］。既往研究表明，GLB 抑制NLRP3 表達后可減弱高脂飲食大鼠體內(nèi)的超氧化物生成、脂質(zhì)過氧化，降低NOX2蛋白水平，改善抗氧化狀態(tài)和胰島素信號通路［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與CTL 組相比，DM 大鼠心臟組織中NLRP3和caspase-1蛋白表達增多，炎癥反應(yīng)增強，證實DM 作為觸發(fā)點能夠使NLRP3 表達上調(diào)，引起炎癥反應(yīng)；與DM 組相比，GLB 組NLRP3和caspase-1 蛋白表達下調(diào)，證實GLB 對NLRP3 的抑制作用可減弱DM大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

NLRP3 炎性小體和ERS 參與體內(nèi)多種病理生理過程。Heijman等［18］研究表明，心臟手術(shù)后房顫患者心房肌細胞NLRP3炎性小體表達增強，對小鼠心房肌細胞予白細胞介素-1β刺激也能增強心房肌細胞NLRP3 和CaMKⅡ的表達。CaMKⅡ是一個多效應(yīng)信號分子，在高血糖、氧化應(yīng)激、缺氧和缺血性損傷條件下，CaMKⅡ活化導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+超載，進一步觸發(fā)ERS，促進心肌細胞死亡［19］。NLRP3 炎性小體可能通過調(diào)節(jié)CaMKⅡ表達啟動ERS。ERS 是細胞的一種保護性應(yīng)激反應(yīng)，是細胞應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣平衡紊亂等狀況而做出的反應(yīng)。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein reaction，UPR）是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由ERS激活，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細胞的分泌功能［20-22］。UPR通路包括3 個主要的信號級聯(lián)，分別由IRE-1α、蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和激活轉(zhuǎn)錄因子6 啟動。慢性ERS 可通過刺激IRE-1α 上調(diào)啟動UPR［23］。在DM中，NLRP3 過度表達導(dǎo)致CaMKⅡ表達上調(diào)，誘發(fā)IRE-1α相關(guān)的ERS過度活化，進而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。氧化應(yīng)激通過脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和線粒體功能障礙在DM各種并發(fā)癥的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用［24-26］。ROS 與NADPH 是細胞內(nèi)各種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子中的關(guān)鍵因子，DM 血糖波動可促進ROS、NADPH過度生成［27-28］。NADPH是一個蛋白質(zhì)家族，包括NOX1-5 和Duox 1/2 共7 個成員，與心肌細胞ER 較為密切相關(guān)的亞型是NOX2、NOX4［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，與CTL 組相比，DM 組大鼠心室肌組織中NLRP3/CaMKⅡ/IRE-1α 和氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物NOX2、NOX4表達上調(diào)，ROS產(chǎn)生增多。與DM組相比，GLB 組NLRP3/CaMK Ⅱ/IRE-1α 表達下調(diào)，NOX2、NOX4 水平下降，ROS 產(chǎn)生減少，表明在高糖狀態(tài)下，NLRP3 活化，進而激活ERS，加劇細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而GLB 抑制NLRP3 表達后，炎癥水平減輕，ERS 反應(yīng)減弱，通路下傳受到抑制，心室肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，心功能得到改善。

綜上所述，高血糖狀態(tài)可誘發(fā)心室肌細胞NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α 通路表達上調(diào)，氧化應(yīng)激增強，影響鼠心室重構(gòu)，GLB可降低ERS和氧化應(yīng)激水平，從而部分逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，這可能為未來DCM臨床治療提供一種新的方法。