文海若 柴學(xué)麗 吳輝 耿興超

化妝品原料進行遺傳毒性評價的背景介紹

化妝品是消費者長期日常使用的產(chǎn)品，涉及各個年齡段。因此，安全作為化妝品研發(fā)的首要因素，受到研發(fā)單位和監(jiān)管機構(gòu)的高度重視。《國際化妝品原料標準中文名稱目錄（2010 年版）》中已收錄了超過15000 種化妝品原料。國內(nèi)《已使用化妝品原料名稱目錄》中收載了近9000 種化妝品原料，目錄以外的化妝品原料視為新原料，經(jīng)過毒理學(xué)評估后方可使用。隨著動物試驗“3R”（reduction， replacement， refinement， 即動物使用的減少、替代和優(yōu)化） 原則和替代理念的推廣，歐盟國家自2013 年3 月起全面禁止銷售經(jīng)過動物試驗的化妝品（含化妝品原料）。國際上，鼓勵使用更先進的科學(xué)手段進行化妝品的安全性評價，包括以風(fēng)險評估的方式減少終產(chǎn)品的毒理學(xué)檢測，以及發(fā)展可靠的毒理學(xué)替代方法。

遺傳毒性試驗用于檢測受試物是否存在誘導(dǎo)機體遺傳物質(zhì)損傷風(fēng)險，從而預(yù)測受試物的致癌性。當(dāng)遺傳毒性試驗結(jié)果為陽性時，提示受試物為潛在的人體致癌劑或致突變劑。腫瘤的發(fā)生機制復(fù)雜，而單一遺傳毒性評價方法難以涵蓋多種檢測終點。故用于監(jiān)管的遺傳毒性數(shù)據(jù)，需來自評價終點互補的體外和體內(nèi)試驗組合，以從多種角度對受試物的遺傳毒性風(fēng)險進行評估?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》列出了6 項遺傳毒性試驗方法，并指出遺傳毒性試驗項目至少包括1 項基因突變試驗和1 項染色體畸變試驗。其中，細菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）是首選的遺傳毒性試驗，與體外哺乳動物細胞試驗相結(jié)合，可檢出絕大多數(shù)導(dǎo)致嚙齒類動物腫瘤的物質(zhì)，其檢測的靈敏性達74.3%[2]。

傳統(tǒng)遺傳毒性試驗方法評價化妝品原料時存在的問題

化妝品是由天然、合成或提取物質(zhì)作為原料經(jīng)調(diào)配加工而成的復(fù)配混合物，如油性原料、粉質(zhì)原料等?；瘖y品原料的性質(zhì)和有色成分可能對Ames 試驗或體外染色體畸變試驗體系產(chǎn)生干擾。如化妝品成分中含有組氨酸或色氨酸成分，則可能在Ames 試驗中得到假陽性結(jié)果。一些在體外哺乳動物微核試驗和染色體畸變試驗中檢測結(jié)果為陽性化學(xué)物質(zhì)（如芳香胺類），在相同檢測終點的體內(nèi)研究中并不具有遺傳毒性或致癌性[3]，其原因與體外試驗系統(tǒng)缺乏體內(nèi)代謝補償機制有關(guān)。再如，微核試驗結(jié)果易于受到pH 值和滲透壓的影響。此外，具有氧化作用機制的化合物在體外評價體系中易于得到假陽性結(jié)果。而過高的細胞毒性是導(dǎo)致體外細胞致裂性試驗假陽性結(jié)果的另一主要因素[4]。此外，化妝品多以局部皮膚外用為主，體內(nèi)吸收和全身分布較少。如有潛在毒性風(fēng)險的對苯二胺人體經(jīng)皮吸收率僅為0.18%[5]，體外試驗中通常選擇較高濃度受試物與細胞作用，試驗結(jié)果與人體毒性外推存在較高不確定性。傳統(tǒng)遺傳毒性評價方法在應(yīng)用于化妝品原料藥的評價時需進行一定優(yōu)化。歐盟化妝品指令第7 次修訂（2003/15/EC） 已于2009 年3 月開始禁止對化妝品成分進行體內(nèi)遺傳毒性試驗?；瘖y品公司考慮到排除體外試驗陽性結(jié)果所需的時間和資源成本，往往會摒棄體外試驗中得到陽性結(jié)果的化學(xué)品原料。目前的體外遺傳毒性試驗研究重點在于如何提高試驗結(jié)果的準確性，并找到更加合適且有效的體外替代模型進行遺傳毒性評價[6]。

歐洲化妝品、盥洗用品和香水協(xié)會（EuropeanCosmetic .Toiletr y and Per fumer y A s sociation，COLIPA） 于2004 年成立了遺傳毒性研究小組，一方面對現(xiàn)有體外標準遺傳毒性試驗方法進行改良，從而減少假陽性結(jié)果；另一方面推進新評價方法作為標準組合試驗結(jié)果為陽性的化合物的后續(xù)選擇。研究發(fā)現(xiàn)，假陽性結(jié)果主要來自II 相代謝酶活力不足的細胞系和p53 功能缺陷的細胞系，前者的解毒能力不足，后者DNA 修復(fù)功能較差。來自人源細胞（如人淋巴細胞、TK6 細胞和HepG2 細胞）的結(jié)果與傳統(tǒng)的CHL、CHO 或V79 相比，特異性更佳[7]。此外，細胞毒性過大可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，試驗時需進行細胞毒性相關(guān)指標檢測，以支持試驗濃度設(shè)置的合理性。

近年來，隨著替代毒理學(xué)的興起和組織工程技術(shù)的應(yīng)用，三維（3 dimensions， 3D） 重組人工皮膚模型在化妝品毒性替代模型的研發(fā)中嶄露頭角。3D 重組皮膚模型使用人來源的皮膚組織構(gòu)建，試驗周期較短，試驗結(jié)果與人體毒性結(jié)果相比更具可比性和針對性。盡管目前研發(fā)的人體皮膚模型尚不包含毛囊、皮脂腺、神經(jīng)、循環(huán)和淋巴系統(tǒng)，研究數(shù)據(jù)與人體臨床試驗數(shù)據(jù)的相關(guān)性還有待商榷，但極有可能在今后列入安全性評價指導(dǎo)原則或相關(guān)標準，在監(jiān)管領(lǐng)域有重要前景。以下就人3D 重組皮膚模型在遺傳毒性評價中的研究進展與應(yīng)用前景進行闡釋。

3D 重組皮膚模型在化妝品原料遺傳毒性評價中的應(yīng)用

皮膚是人類最大的器官，由多種類型的細胞共同構(gòu)成阻擋有害物質(zhì)進入機體的第一道天然屏障。首個體外表皮模型于20 世紀70 年代成功構(gòu)建，其初衷是解決臨床患者大面積皮膚損傷與缺失修復(fù)的瓶頸，之后逐漸應(yīng)用于體外化妝品安全性評價[8]。3D 重組皮膚模型將人皮膚細胞培養(yǎng)于特殊的插入式培養(yǎng)皿后得到，具有完整的3D 皮膚解剖結(jié)構(gòu)，從功能和結(jié)構(gòu)上模擬人體皮膚，在化妝品毒性評價中具有重要價值。因此，難溶的、膏狀和油脂類配方的受試物以涂抹的方式放到皮膚模型上，解決了體外試驗中化妝品制劑性質(zhì)特殊的問題。此外，3D 皮膚模型可以提供毒代動力學(xué)數(shù)據(jù)為毒理學(xué)數(shù)據(jù)分析提供支持。然而，因當(dāng)前模型不包含毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬結(jié)構(gòu)，且屏障功能低于真實皮膚，3D 模型試驗中的經(jīng)皮吸收率通常高于真實人群使用情況[9]。今后應(yīng)著重研發(fā)與人體接近的、適合不同類產(chǎn)品評價需求的、穩(wěn)定的、可長期重復(fù)給藥的皮膚模型。

目前已應(yīng)用于遺傳毒性試驗研究的商品化皮膚模型包括美國MatTek 的EpiDermTM 和Epi-200 和法國歐萊雅的EpiSkinTM。其中表皮模型主要用于微核試驗，而全皮模型則更適用于靈敏度較高的彗星試驗。

1. 微核試驗

COLIPA 組織歐盟、美國及日本多家實驗室開展基于EpiDermTM 的國際實驗室間聯(lián)合驗證，通過試驗方法標準化、已知毒性受試物小范圍驗證和大量受試物實驗室間聯(lián)合驗證逐步確認試驗方法及其復(fù)現(xiàn)性[10]。當(dāng)前已完成29 個受試物的大規(guī)模驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)EpiDermTM 的特異性達到88.1%，靈敏性達62.5%， 而一致性達到81%。比較EpiDermTM 和正常人表皮角化細胞對多種已知體內(nèi)非遺傳毒性及遺傳毒性化合物的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受試物不經(jīng)S9作用即可得到接近體內(nèi)的研究結(jié)果，與此同時EpiDermTM也可較好地排除因毒性引起的體外培養(yǎng)細胞假陽性結(jié)果[11]。Hu et al 也使用EpiDermTM 對7 種化合物開展驗證并指出該模型可實現(xiàn)接近體內(nèi)研究的暴露條件，有效對染色體損傷風(fēng)險作出預(yù)測[12]。近年來，EpiSkinTM 皮膚模型也陸續(xù)開展微核試驗的驗證工作，一項就17 種化合物的胞質(zhì)分裂阻斷法微核試驗研究發(fā)現(xiàn)其用于評估化合物遺傳毒性的特異性、準確性及一致性分別達到60～75%、83～85% 和76～82%，且72 小時長時間暴露于受試物的方式可有效提高遺傳毒性物質(zhì)的檢出率[13]。中國EpiSkinTM皮膚模型微核試驗方法已于我國完成初步驗證，結(jié)果顯示該模型的穩(wěn)定性和細胞增殖活力可滿足試驗需求，并可確將陽性物質(zhì)長春新堿、N- 乙基-N- 亞硝基脲、3-丁內(nèi)酯、2-乙酰氨基芴和陰性物質(zhì)環(huán)己酮、2，4- 二氯苯酚的遺傳毒性進行歸類，證明其具備一定預(yù)測能力，在今后將進一步驗證并推廣。MatTek 的Epi-200 皮膚模型也完成了歷時7 年的微核試驗聯(lián)合驗證[14]。美國和歐洲的4 個實驗室對43個化合物的驗證結(jié)果顯示，與體內(nèi)遺傳毒性結(jié)果相比，該模型總體準確率為 80%，靈敏度為 75%，特異性為 84%；實驗室間和實驗室內(nèi)的重現(xiàn)性分別為 77% 和 84%。 此外，72h 暴露方案比48h 更為靈敏。當(dāng)前使用三D 皮膚模型微核試驗數(shù)據(jù)作為化妝品安全性監(jiān)管的資料已提交至歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validationof Alternative Methods， ECVAM）。

2. 彗星試驗

彗星試驗主要用于預(yù)測受試物的DNA 反應(yīng)性，可與體外微核試驗形成互補。COLIPA 已分階段使用EpiDermTM 開展體外彗星試驗實驗室間聯(lián)合驗證工作。在第一階段和第二驗證的工作中分別使用甲磺酸甲酯、4-硝基喹啉、乙?；鶃喯趸?、2，4- 二氨基甲苯、硝基苯酚、環(huán)己酮等對模型進行驗證，發(fā)現(xiàn)該模型的復(fù)現(xiàn)性較好。然而溶劑組背景值過高（高于30%） 成為進一步大規(guī)模驗證的瓶頸。也有研究提示使用尚未發(fā)育完全的細胞模型EPI-201 可減少運輸時長對皮膚模型質(zhì)量的影響，從而降低背景值[15]。化妝品歐洲遺傳毒性專項組（CosmeticsEurope Genotoxicity Task Force） 和德國聯(lián)邦教育與研究部使用全皮模型如EpiDerm FT 或Phenion? FT研究使用其開展彗星試驗的重復(fù)性和預(yù)測效力[16]。在Reisinger 等[16] 進行的驗證研究中，使用絲裂霉素C、氯化鎘、N- 乙基-N- 硝基脲、7，12- 二甲基苯并蒽、沒食子酸丙酯、丁香酚、鄰苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯、環(huán)己酮等8 種化學(xué)品在Phenion? 全層皮膚模型上進行驗證，3D 皮膚彗星測定法顯示出較高的預(yù)測能力以及良好的實驗室內(nèi)和實驗室間可重復(fù)性。

Flamand et al，使用EpiSkinTM 研究洛美沙星的光遺傳毒性，即模型涂抹洛美沙星并經(jīng)紫外照射后再取皮膚組織開展彗星試驗，驗證只有洛美沙星涂抹與紫外照射同時存在時組織細胞的尾DNA 百分率顯著性升高，提示其存在光遺傳毒性。該結(jié)果與人體皮膚試驗結(jié)果一致[17]，提示模型具有較好的代謝功能。我國研發(fā)的人源重建皮膚模型EpiKutis 也已使用鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8- 甲氧基補骨脂和十二烷基硫酸鈉建立了國產(chǎn)人源重建皮膚模型的體外光毒性試驗方法[18]，為皮膚光毒性替代檢測方法提供了新補充。

化妝品遺傳毒性評價的決策思路

COLIPA 基于上述研究結(jié)果，提出以下化妝品遺傳毒性評價的決策思路[6]。首先應(yīng)根據(jù)已有的數(shù)據(jù)和資料，包括理化屬性、暴露和代謝方式、遺傳毒性及致癌性數(shù)據(jù)對化妝品原料的風(fēng)險進行預(yù)判。在此基礎(chǔ)上進行證據(jù)權(quán)重分析（weight of evidence，WoE），判斷是否有足夠數(shù)據(jù)支持化合物具有或不具有遺傳毒性風(fēng)險。如果當(dāng)前數(shù)據(jù)足夠作出判斷，則進行風(fēng)險評估分析，認為化合物具有遺傳毒性或人體暴露后的致癌性風(fēng)險極低，無需后續(xù)試驗。如果當(dāng)前數(shù)據(jù)不足以作出判斷，則開展Ames 試驗、體外微核試驗/ 染色體畸變試驗或哺乳動物細胞基因突變試驗。體外試驗結(jié)果均為陰性時，再次使用證據(jù)權(quán)重法進行分析并得到結(jié)論。如體外試驗結(jié)果為陽性，需判斷所選擇的試驗方法是否適宜及是否充分。

體外試驗結(jié)果為陽性的第一種可能即Ames 試驗結(jié)果為陽性，而體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結(jié)果為陰性。此時，需進行哺乳動物基因突變試驗。如hprt 基因突變試驗為陰性，再結(jié)合Ames 試驗陽性結(jié)果與哺乳動物試驗體系的不相關(guān)性分析，可排除Ames 試驗陽性結(jié)果帶來的遺傳毒性風(fēng)險擔(dān)憂。另一個方案是開展敘利亞倉鼠胚胎（Syrian hamster embryo，SHE） 細胞轉(zhuǎn)化試驗。該方法通過檢測原代SHE 細胞形態(tài)變化，評價化合物的致癌性風(fēng)險，試驗結(jié)果與嚙齒動物致癌性評價數(shù)據(jù)的一致性達到近80%[19]。含芳香胺化合物的染發(fā)劑通常在Ames 試驗中得到陽性結(jié)果，但SHE 試驗可以對存在致癌性的芳香胺和非致癌性的芳香胺進行準確的區(qū)分（結(jié)果準確率達到90%）[20]。它也可以對遺傳毒性致癌性化合物（直接作用于機體遺傳物質(zhì)的致癌物） 和非遺傳毒性致癌性化合物（不直接作用于機體遺傳物質(zhì)的致癌物） 進行區(qū)分。值得注意的是，因該方法涉及放射線的使用，其推廣和普及受到了限制。此外，基于3D 皮膚模型的彗星試驗也可以作為第三種選擇。彗星試驗有助于檢測到廣譜的DNA 損傷（包括基因突變和染色體損傷）。此外，可考慮Ames 試驗結(jié)果為陽性是否與閾值有關(guān)。基于機體的保護性DNA修復(fù)機制，人體通常可容忍低水平DNA 損傷，如果實際暴露量低于某一閾值則致癌性風(fēng)險可忽略。如研究發(fā)現(xiàn)烷化劑甲磺酸乙酯在體外和體內(nèi)均存在作用閾值[21]。進行閾值分析時需結(jié)合暴露水平與閾值濃度進行評估。

體外試驗結(jié)果為陽性的第二種可能即Ames 試驗結(jié)果為陰性，而體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結(jié)果為陽性。后續(xù)試驗的首選方法是開展基于3D 皮膚模型的微核試驗或彗星試驗，然而該試驗尚不能成為一個獨立的系統(tǒng)，但作為常規(guī)體外微核和彗星試驗的后續(xù)試驗有助于證據(jù)權(quán)重評估[6]。此外，SHE 細胞轉(zhuǎn)化試驗和閾值分析也可作為備選后續(xù)評估方法。

體外試驗結(jié)果為陽性的第三種可能即Ames 試驗結(jié)果和體外微核試驗/ 染色體畸變試驗結(jié)果均為陽性。則需要根據(jù)前兩種可能的后續(xù)試驗選擇考慮開展適當(dāng)?shù)脑囼炦M行驗證[6]。

小結(jié)與展望

化妝品原料的遺傳毒性風(fēng)險應(yīng)根據(jù)其本身的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能類似物的信息、代謝物等的現(xiàn)有數(shù)據(jù)或預(yù)測結(jié)果，以證據(jù)權(quán)重的方式做出評估?；?D 皮膚模型的微核試驗和彗星試驗為骨髓和外周血暴露量較低的化合物的遺傳毒性評價，提供了有價值的評價方法。對于局部涂抹類藥物而言，如在標準遺傳毒性試驗組合中體外微核/ 染色體畸變試驗中獲得陽性結(jié)果，可考慮以3D 皮膚微核/ 彗星試驗作為后續(xù)試驗選擇。應(yīng)用3D 皮膚模型開展體外微核試驗和彗星試驗獲得的數(shù)據(jù)與2D 培養(yǎng)條件下獲得的結(jié)果相比，假陽性率更低，準確性更高。而基于3D 皮膚模型的彗星試驗作為微核試驗的重要補充，后續(xù)需對試驗條件進行進一步優(yōu)化。在體外替代評價方法大行其道的趨勢下，如何優(yōu)化體外遺傳毒性評價試驗條件及策略、驗證3D 模型的代謝能力和確證該模型的可靠性，成為現(xiàn)階段需著力攻克的重點。