紀佼佼，徐多麒，向平，嚴慧，沈敏

1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；2.復旦大學基礎醫(yī)學院，上海 200032

藥物輔助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）是一個總稱，包括受精神藥物影響實施的強奸或其他形式的性侵犯、搶劫、勒索錢財以及故意虐待老人或兒童的犯罪行為[1]。藥物輔助性犯罪（drug-facilitated sexual assault，DFSA）是藥物輔助犯罪案件的一個子集，在DFSA 案件中，具有精神活性的藥物被用來改變一個人的意識和行為，從而實施性犯罪，涉及的物質主要包括乙醇、γ-羥基丁酸、苯二氮?類藥物、非苯二氮?類新型鎮(zhèn)靜安眠藥物（Z-藥物）等[2-4]。然而，DFSA 案件給法醫(yī)毒物學者帶來了挑戰(zhàn)，因為從案發(fā)到檢測通常經歷時間較長，且這類案件藥物劑量較低，隨著體內代謝的消除，藥物在血液和尿液中無法檢出[5]。為了延長檢測窗口，毛發(fā)分析已成為法醫(yī)毒物學和臨床毒理學領域解決DFSA 案件必不可少的技術手段[6-7]。

根據頭發(fā)的長度，頭發(fā)中藥物的檢測時限可達幾周或幾個月。此外，對頭發(fā)樣本中精神活性物質的分段分析可以對藥物攝入史進行評估，并且區(qū)分長期及單次用藥。在常規(guī)的頭發(fā)分段分析中，通常是將束發(fā)剪成1～2 cm 的片段，將同一片段的頭發(fā)合并為一個樣本，以10～20 mg 的樣本量進行分析[8-9]。然而，這種常規(guī)毛發(fā)分段分析的時間分辨率僅處于月水平而無法對藥物攝入時間進行更精確的估計[10]。根據頭發(fā)1 cm/月的生長速度，若對單根頭發(fā)采用以對應的日生長長度0.4 mm 為單位的更為精細的微分段分析，可以減少多余空白頭發(fā)基質對藥物的稀釋作用，并且可以將估計攝藥時間的分辨率提高到日水平[11]。

在既往研究[12]中，本課題組應用兩個DFSA 案例比較了毛發(fā)微分段分析與常規(guī)的1 cm 分段分析方法，結果表明，微分段分析可以提高毛發(fā)中藥物檢測的實用性，增強DFSA案件的證據力。近年來，基質輔助激光解吸電離-質譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）技術由于其高分辨率、可原位分析、結果可視化等優(yōu)勢，在單根頭發(fā)的藥物分布研究中受到廣泛關注[13-15]。然而，液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對生物樣品中藥物定性和定量分析的靈敏度要優(yōu)于MALDI-MSI[16]。因此，采用LC-MS/MS 法能夠實現對于亞毫米頭發(fā)片段中的藥物檢測和分析。本研究旨在建立一種覆蓋42種常見精神活性物質的單根頭發(fā)微分段分析方法并應用于單次服用唑吡坦的志愿者頭發(fā)樣本，以探究單根頭發(fā)微分段分析方法在解決DFSA案件中的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

QTRAP 6500+三重四極桿線性離子阱復合質譜系統(tǒng)（美國AB Sciex 公司）配備AcquityTMUltra performance LC I-CLASS 超高效液相色譜儀（美國Waters公司），SB-2200-T 超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設備有限公司）。

42 種精神活性物質及3 種內標的標準溶液均為質量濃度為1 mg/mL 的甲醇溶液。苯海拉明、地芬尼多、東莨菪堿、安替比林購于上海安譜實驗科技股份有限公司，苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可卡因、苯甲酰愛康寧、麥角二乙胺、芬太尼、氟硝西泮、7-氨基氟硝西泮、三唑侖、α-羥基三唑侖、可待因、地西泮、去甲地西泮、替馬西泮、奧沙西泮、阿普唑侖、α-羥基阿普唑侖、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、艾司唑侖、勞拉西泮、咪達唑侖、硝西泮、7-氨基硝西泮、唑吡坦、西酞普蘭、右美沙芬、氯氮平、右美托咪定、曲馬多、卡馬西平、奧卡西平、尼美西泮、喹硫平、米氮平以及3 種內標（氯胺酮-d4，地西泮-d5，喹硫平-d8）的對照品購自美國Cerilliant 公司，思諾思酒石酸唑吡坦片（10 mg，含10 mg 酒石酸唑吡坦/片）購自賽諾菲（杭州）制藥有限公司。二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）購自美國Sigma-Aldrich 公司，98%甲酸溶液和98%乙酸銨溶液購自瑞士Fluka 公司，超純水由Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制備。

1.2 溶液配制

1.2.1 混合標準物質工作液配制

取42 種精神活性物質的標準物質適量，加入甲醇配制成質量濃度為1 μg/mL 的混合標準物質工作液。隨后用甲醇稀釋成質量濃度為16～40 000 pg/mL的混合工作溶液。

1.2.2 混合內標工作液配制

取3 種內標對照品適量，加入甲醇配制成質量濃度為10 μg/mL 的混合內標工作液。隨后用甲醇稀釋成質量濃度為0.5 ng/mL 的混合內標工作溶液。

所有工作溶液在使用前均置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 提取溶液配制

毛發(fā)提取介質為V甲醇∶V乙腈∶V2mmol/L甲酸銨（8%乙腈，pH=5.3）=25∶25∶50 的混合物。提取溶劑為將DTT 溶解于毛發(fā)提取介質（extraction medium，EM）溶液中制備成的質量濃度為10 mg/mL 的DTT-EM 溶液。

1.3 樣本來源

空白頭發(fā)樣本采集自10 名未攝入上述精神活性物質的健康志愿者，用于制備校正曲線及質量控制樣品。

志愿者頭發(fā)樣本（黑色，8 cm）來自一名本實驗室工作人員（女性，32 歲），在本研究之前未服用過精神藥品，在本研究中單次服用唑吡坦后28 d，用鑷子從后枕部拔取5 根頭發(fā)，標記根部，4 ℃保存供分析。

本研究已通過司法鑒定科學研究院倫理委員會審批，實驗前告知志愿者藥物實驗風險并簽署知情同意書。

1.4 樣本前處理

用去離子水和丙酮擦拭頭發(fā)樣本，以避免外部污染干擾分析，室溫下干燥。然后將單根頭發(fā)粘在膠帶上，用外科手術剪刀在30 倍的放大鏡下將其剪成長0.4 mm 的片段，該長度與頭發(fā)每日的生長長度[17]大致一致。將每個0.4 mm 的頭發(fā)片段置于200 μL 的微量離心管中，加入5 μL 內標和20 μL DTT-EM 溶液，超聲1 h，浸泡20 h。取上清液供LC-MS/MS 分析。對于實驗頭發(fā)樣本，將5 根頭發(fā)的近根端2 cm 分成50 段0.4 mm 的片段，標記為S1、S2……S50，并按照上述方法進行提取。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Allure PFPP 柱（100 mm×2.1 mm，5 μm；美國Restek 公司）。流動相A 為20 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸和5%乙腈的水溶液，流動相B 為乙腈。采用線性梯度洗脫，洗脫程序見表1。自動進樣器溫度為4 ℃，進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.5.2 質譜條件

采用電噴霧離子源正離子（positive electrospray ionization，ESI+）模式，在多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下采集數據。ESI 參數設置如下：離子源溫度450 ℃；氣簾氣（N2）30 psi；離子噴射電壓5 500 V，碰撞室出口電壓10 V、入口電壓10 V；離子源氣體1（GS1）35 psi，離子源氣體2（GS2）35 psi。MRM 參數和保留時間見表2。

表2 42 種精神活性物質及3 種內標的MRM 參數和保留時間Tab.2 MRM parameters and retention times for 42 psychoactive substances and 3 internal standard substances

1.6 方法學驗證

1.6.1 選擇性

取10 份不同來源的空白頭發(fā)樣品，分別按照1.4 節(jié)方法進行樣品前處理，考察頭發(fā)樣品中的內源性物質是否干擾42 種精神活性物質的測定。

1.6.2 線性、檢出限和定量限

校準曲線范圍從每個化合物的最低定量限到500 pg/mm。將工作溶液添加到空白的單根0.4 mm 頭發(fā)片段中，配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、250 和500 pg/mm 的加標頭發(fā)樣品，并對每個校準水平進行3 次重復評估。以每個分析物的濃度為橫坐標（x），以定量離子對與內標的峰面積比為縱坐標（y），使用加權最小二乘法（1/x）進行回歸計算獲得曲線方程，相關系數（r）至少為0.99。以信噪比（S/N）≥3為檢出限（limit of detection，LOD），以S/N≥10 且精密度的變異系數小于20%，準確度在80%和120%之間為最低定量限（lower limit of quantitation，LLOQ）[18]。

1.6.3 精密度和準確度

在0.4 mm 空白頭發(fā)樣品中加入42 種精神活性物質的混合工作溶液，配制成濃度為LLOQ 和250 pg/mm兩個濃度的質量控制（quality control，QC）樣品，每個濃度點制備6個平行樣品，按照1.4節(jié)方法進行樣本前處理，連續(xù)測定4 d。精密度用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來評估。經線性方程計算的測定值與實際添加混合工作溶液的濃度的百分比為準確度。要求LLOQ 樣品的精密度不超過20%，其余QC 樣品的精密度不超過15%；LLOQ 樣品的準確度在80%～120%，其余QC 樣品的準確度在85%～115%[18]。

1.6.4 基質效應和提取回收率

按照MATUSZEWSKI 等[19]提出的方法考察基質效應和提取回收率。選取低濃度（LLOQ）和高濃度（250 pg/mm）作為QC濃度進行考察。將超聲和浸泡處理前的加標頭發(fā)樣品中各化合物的峰面積記為SA，超聲和浸泡處理后的加標頭發(fā)樣品中各化合物的峰面積記為SB，在相應濃度的純標準溶液中各化合物的絕對峰面積記為SC。用生成峰面積SB/SC×100%計算基質效應，用生成峰面積SA/SB×100%計算提取回收率。

2 結果與討論

2.1 微分段分析濃度單位的選擇

關于單根頭發(fā)微分段分析單位的選擇，既往研究[20-21]中報道不一。由于0.4 mm的頭發(fā)片段質量較小，實驗室常規(guī)的稱量設備無法直接對其質量進行精確稱量。KUWAYAMA等[20]提出可以測量1根頭發(fā)的長度并稱量其質量，根據其質量從而估計每一段頭發(fā)的平均質量。該研究對22根頭發(fā)進行了稱重并測量，0.4 mm頭發(fā)片段的質量在2.29～6.42 μg。然而，WIEDFELD等[21]認為，即使根據頭發(fā)片段的平均質量進行計算，個體間和個體內頭發(fā)直徑的差異也會影響濃度的準確性。此外，清洗、燙染和天氣變化可能會增加頭發(fā)角質層的損傷和降解，不同發(fā)絲間的含水量也可能不同，質量可能存在2～3 倍的差異。因此，以長度為單位對濃度的反映更為準確且方便。

2.2 方法學驗證

2.2.1 選擇性

10 份不同來源的空白頭發(fā)樣品經樣品前處理后，在待測化合物對應的保留時間處均無內源性干擾以及內標的干擾，說明該方法的選擇性良好?？瞻最^發(fā)與空白頭發(fā)添加20 pg/mm 42 種精神活性物質的色譜圖見圖1。

圖1 空白頭發(fā)（A）與空白頭發(fā)添加20 pg/mm 42 種精神活性物質（B）的色譜圖Fig.1 The chromatograms of hair collecting before administration（A）and 42 psychoactive substances spiked at 20 pg/mm（B）

2.2.2 線性、LOD 和LLOQ

本研究中所有化合物在各自線性范圍內線性關系良好（r＞0.99）。LOD 為0.2～10 pg/mm，LLOQ 為0.5～20 pg/mm。在該方法覆蓋的42 種化合物中，26 種物質（61.9%）的LLOQ≤5 pg/mm，8 種物質（19.0%）的LLOQ≤1 pg/mm。各化合物的回歸方程、相關系數（r）、LOD 和LLOQ 見表3。

表3 頭發(fā)中42 種精神活性物質的回歸方程、相關系數（r）、LOD 和LLOQTab.3 Regression equation，correlation coefficient（r），LOD and LLOQ of 42 psychoactive substances in hair

2.2.3 精密度和準確度

本研究中各化合物的精密度和準確度見表4。該方法的日內精密度為1.5%～11.8%，日內準確度為86.5%～105.7%，日間精密度為2.8%～12.7%，日間準確度為88.2%～109.2%。精密度均在15%以內，準確度均在85%～115%，表明該方法的精密度和準確度良好。

表4 頭發(fā)中42 種精神活性物質的精密度、準確度、回收率和基質效應Tab.4 Precision，accuracy，recovery and matrix effect of 42 psychoactive substances in hair （%）

2.2.4 提取回收率和基質效應

本研究中各化合物的提取回收率為68.1%～98.2%，基質效應為71.3%～111.7%，詳見表4。

2.3 案例應用

運用本研究方法對單次服用1 片唑吡坦（含10 mg酒石酸唑吡坦/片）28 d 后的志愿者單根頭發(fā)（實驗樣本）進行分析。結果顯示，5 根頭發(fā)中唑吡坦的檢出位置位于S28～S40（近根端1.08～1.60 cm），濃度范圍為0.62～20.5 pg/mm。單根頭發(fā)中唑吡坦的總含量為47.2～72.1 pg，平均含量為56.9 pg（n=5），這一結果與之前的報道接近。SHIMA 等[22]對單次服用10 mg 酒石酸唑吡坦后35 d 的黑色頭發(fā)進行分析，發(fā)現單根頭發(fā)中含有的藥物總含量范圍為27～63 pg，平均含量為43 pg（n=14）。本例5 根頭發(fā)中4 根的峰值濃度出現在S34（近根端1.36 cm），1 根頭發(fā)的峰值濃度出現在S36（近根端1.44 cm），詳見圖2。根據已知的服藥時間計算可知，該志愿者的頭發(fā)生長速度為0.49～0.51 mm/d，約為1.5 cm/月，比通常認為的1 cm/月要快。因此，不同個體的頭發(fā)生長速度存在差異。在藥物輔助犯罪案件中，需要以個體本身頭發(fā)的生長速度進行推算，以提高藥物攝入時間估計的準確性。

圖2 唑吡坦在5 根頭發(fā)中的分布Fig.2 Distribution of zolpidem in 5 hairs

3 結論

本研究建立了0.4 mm 頭發(fā)片段中42 種精神活性物質的LC-MS/MS 定性定量分析方法，并成功應用于單次服用唑吡坦的志愿者頭發(fā)樣本的分析，在5 根頭發(fā)中均檢出唑吡坦，表明頭發(fā)微分段分析技術可用于唑吡坦單次攝藥案件的檢測。然而，同一個體的頭發(fā)間可能處于不同的生長階段[23]，在對案件結果進行分析和評價時，需要盡量基于多根頭發(fā)的分析結果以排除操作誤差及偶然性。此外，未來還需要將微分段分析技術應用于涉及更多藥物的案例中，以進一步證明單根頭發(fā)微分段分析技術在DFSA 案件中的可行性。