張旭東，姜垚如，梁芯瑞，田甜，靳茜茜，張小紅，曹潔，杜秋香，孫俊紅

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.禹州市公安局，河南 禹州 452570；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；4.鄒平市公安局，山東 鄒平 256200

準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的一個(gè)關(guān)鍵問題，死后相關(guān)生物技術(shù)分析可為其提供重要、可靠的數(shù)據(jù)。法醫(yī)昆蟲學(xué)[1]或形態(tài)學(xué)[2]分析可為死亡時(shí)間推斷提供基礎(chǔ)依據(jù)，但因易受外界復(fù)雜環(huán)境的影響，存在一定的局限性和不穩(wěn)定性。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究者們愈發(fā)關(guān)注生物大分子如RNA[3-4]、DNA[5-6]或蛋白質(zhì)[7-8]的死后變化。近年來，機(jī)體死后骨骼肌蛋白質(zhì)降解的相關(guān)研究取得了重大進(jìn)展。在標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型中，可通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western 印跡分析，發(fā)現(xiàn)如蛋白磷酸酶2A、結(jié)蛋白、肌鈣蛋白[7-8]等特定蛋白質(zhì)的降解模式。此外，死后變化如天然蛋白條帶的丟失或特定降解產(chǎn)物的出現(xiàn)，與死亡時(shí)間顯著相關(guān)[9]。

利用蛋白質(zhì)芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢(shì)[10]。2100 生物分析儀（美國(guó)Agilent 公司）集成多個(gè)實(shí)驗(yàn)程序，包括樣品處理、分離染色、脫色、檢測(cè)和分析，在其基礎(chǔ)上結(jié)合蛋白質(zhì)芯片，可分析多種蛋白質(zhì)樣品。目前，蛋白質(zhì)表達(dá)譜的應(yīng)用主要集中在臨床疾病檢驗(yàn)、藥物研制及物種鑒定等領(lǐng)域[11]。

本研究收集死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌及人體骨骼肌樣本，采用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)技術(shù)獲取死后蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過多維統(tǒng)計(jì)方法，探索蛋白質(zhì)含量變化與死亡時(shí)間的關(guān)系，建立死亡時(shí)間預(yù)測(cè)模型，為死亡時(shí)間推斷提供新的思路和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

健康成年雄性SD 大鼠8 只，10～12 周齡，體質(zhì)量200～230 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。溫室飼養(yǎng)2 d，腹腔注射20%烏拉坦（1 g/kg，北京索萊寶科技有限公司）麻醉后頸椎脫臼處死，死后放入16 ℃人工氣候箱。于死后0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d 和9 d 分別取每只大鼠右后肢腓腸?。?00±2）mg，重復(fù)收集大鼠的肌肉組織樣本，每次收集后保持皮膚覆蓋，共收集80份樣本。樣本于液氮速凍后放入-80 ℃冰箱待檢。

收集2021 年山西醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心9 例不同死亡時(shí)間人體骨骼肌樣本，按序編為1～9 號(hào)，其中3 例經(jīng)冷藏（計(jì)算死亡時(shí)間時(shí)除去尸體冷藏時(shí)間），樣本信息詳見表1。樣本均為無損傷、無出血的胸大肌，每份肌肉組織為（200±2）mg，于液氮速凍后放入-80 ℃冰箱待檢。

表1 9 例人體樣本的詳細(xì)信息Tab.1 Details of 9 human cadaver samples

本研究已獲得山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（審批文號(hào)：2020LL149）。

1.2 蛋白質(zhì)提取

將大鼠和人體的骨骼肌在液氮中研磨至粉末狀后置入微量離心管，同時(shí)將蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；武漢博士德生物工程有限公司）與純水按1∶3.5的質(zhì)量濃度比（kg/L）加入離心管，冰上孵育1 h，以12 000×g離心20 min，吸取上清液400 μL 分裝備用。

從每只大鼠10 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白上清液中各取50 μL，混勻制成400 μL 的質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，共8 份。

1.3 蛋白質(zhì)芯片樣本制備及檢測(cè)

根據(jù)蛋白質(zhì)230 試劑盒（美國(guó)Agilent 公司）說明書在4 μL 樣本中加入2 μL 變性劑，將樣本溶液和Ladder 置入100 ℃水浴中加熱5 min，再加入84 μL 去離子水進(jìn)一步稀釋，從稀釋液中取6 μL 加載到蛋白質(zhì)芯片相應(yīng)的孔道中。

每個(gè)芯片加載10 個(gè)樣本，然后將芯片置于2100生物分析儀中進(jìn)行分析，20～30 min 后，獲取每個(gè)樣本相對(duì)分子質(zhì)量為14 000～230 000 的水溶性蛋白質(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用2100 Expert 軟件（美國(guó)Agilent 公司）獲取大鼠和人體骨骼肌蛋白質(zhì)凝膠電泳圖和電泳色譜圖。根據(jù)內(nèi)標(biāo)“l(fā)ower marker”和“upper marker”對(duì)電泳色譜進(jìn)行定標(biāo)識(shí)別，并對(duì)峰位進(jìn)行校正調(diào)整。為消除雜質(zhì)干擾，去除熒光強(qiáng)度在10 FU 以下的峰[12]。將遷移時(shí)間（相對(duì)分子質(zhì)量大?。┗疽恢碌姆逵洖橄嗤幪?hào)，對(duì)峰含量進(jìn)行歸一化處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）對(duì)8 份QC樣本進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)組間是否存在差異；再行多重比較最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)，分析QC 樣本是否存在差異。采用SIMCA 14.1 軟件（瑞典Umetrics 公司）對(duì)死后各時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌樣本的峰高數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）降維，結(jié)合正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）判別分析死后各時(shí)間點(diǎn)之間的差異，其中R2、Q2表示模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力，R2、Q2終點(diǎn)越接近，同時(shí)Q2回歸直線與Y軸有負(fù)截距，說明模型有效，無過度擬合現(xiàn)象。R2X、R2Y分別為模型對(duì)自變量X、因變量Y的解釋能力。當(dāng)Q2＞0.5 且與R2Y差值不超過±0.3 時(shí)，認(rèn)為模型有效、數(shù)據(jù)可靠[13]，用基于交互驗(yàn)證的方差分析（cross validation-analysis of variance，CV-ANOVA）檢驗(yàn)死后不同時(shí)間點(diǎn)樣本間的差異。采用SPSS Clementine 12.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）分別建立Fisher 判別模型和反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，對(duì)死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌樣本進(jìn)行分類預(yù)測(cè)，隨機(jī)選取70%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集、30%的數(shù)據(jù)作為測(cè)試集，分別獲取兩個(gè)模型的內(nèi)部交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率及外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率，同時(shí)以混淆矩陣總結(jié)BP模型的預(yù)測(cè)能力。使用Morpheus分析軟件（https://clue.io/morpheus/）對(duì)人體骨骼肌蛋白質(zhì)中各峰的含量進(jìn)行熱圖及聚類分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)表達(dá)譜峰分析及模型建立

2.1.1 大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)譜峰特征及差異性

QC 樣本的單因素方差分析及多重比較結(jié)果表明，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

死后不同時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)的譜峰形狀相近，多數(shù)峰位置一致但峰高不同（圖1A～B）；凝膠電泳圖中各條帶隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)有所變化（圖1C），在保留時(shí)間24 s 時(shí)，死后0 d 與9 d 蛋白條帶存在明顯差異。在死后0～9 d 的所有蛋白質(zhì)樣本中共識(shí)別出25 個(gè)峰（按序編號(hào)為1～25），各峰含量（蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量）在死后不同時(shí)間點(diǎn)具有差異性，峰10 在死后0～3 d 含量較高，而在死后4～9 d 含量逐漸減少，同時(shí)某些峰（如峰14）在死后0～9 d 的含量始終維持較高的水平（圖1D）。

圖1 死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig.1 Protein expression of rat skeletal muscles at different time points after death

PCA 模型指標(biāo)良好（R2=0.866，Q2=0.654），可解釋大部分的數(shù)據(jù)變異（圖2）。死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)譜峰隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)呈一定的聚集趨勢(shì)，但模型為無監(jiān)督學(xué)習(xí)，部分死亡時(shí)間段內(nèi)差異不能完全顯現(xiàn)，需進(jìn)一步分析。

圖2 死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)譜峰的PCA 模型Fig.2 PCA model of rat skeletal muscle protein peaks at different time points after death

組間OPLS 判別分析發(fā)現(xiàn)，死后0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 和9 d 兩兩時(shí)間點(diǎn)間均可分離，模型R2、Q2值均大于0.5，且CV-ANOVA 結(jié)果顯示各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；6 d、7 d、8 d 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)間較難分離且CV-ANOVA 中P＞0.05。

2.1.2 死亡時(shí)間預(yù)測(cè)模型

對(duì)80 份大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行Fisher 判別分析，典型判別函數(shù)圖顯示死后10 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分離效果尚可（圖3A），但部分樣本存在重疊交叉現(xiàn)象，模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證的準(zhǔn)確率分別為71.4%和66.7%，準(zhǔn)確率較低。

圖3 大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)樣本的死亡時(shí)間預(yù)測(cè)模型Fig.3 Prediction model of postmortem interval in protein samples from rat skeletal muscles

以蛋白質(zhì)樣本為數(shù)據(jù)節(jié)點(diǎn)、死亡時(shí)間為輸出節(jié)點(diǎn)、25 個(gè)峰為輸入節(jié)點(diǎn)的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證的準(zhǔn)確率分別為98.2%和95.8%，以混淆矩陣結(jié)合散點(diǎn)圖判斷BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分類預(yù)測(cè)結(jié)果中，行代表預(yù)測(cè)時(shí)間點(diǎn)，列代表實(shí)際時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在5 d、7 d 各有1 例錯(cuò)判（圖3B）。

經(jīng)兩種模型的比較，BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的穩(wěn)定性和對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)能力。

2.2 人體骨骼肌蛋白質(zhì)表達(dá)譜峰分析

將人體骨骼肌蛋白質(zhì)樣本中識(shí)別出的16 個(gè)峰按序標(biāo)記為a～p，發(fā)現(xiàn)各峰形狀、位置基本一致（圖4A）。案例1（死后4 d）樣本的個(gè)別峰與其余8 例略有差異，其峰識(shí)別個(gè)數(shù)最少（10 個(gè)），案例6（死后22 h）樣本的峰識(shí)別個(gè)數(shù)最多（13 個(gè)）。

圖4 死后人體骨骼肌蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig.4 Protein expression of human skeletal muscles after death

進(jìn)一步探究人體蛋白質(zhì)譜峰含量在不同死亡時(shí)間點(diǎn)的分布狀態(tài)和規(guī)律，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)不同譜峰含量隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化，如峰a 含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，峰e(cuò) 含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，峰i 與峰e(cuò) 趨勢(shì)相反。根據(jù)峰含量對(duì)死亡時(shí)間進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)死后4 d 的蛋白質(zhì)樣本與死后25 h 內(nèi)的蛋白質(zhì)樣本明顯分離，各峰含量隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)呈一定的時(shí)序性變化（圖4B）。

3 討論

死后機(jī)體蛋白質(zhì)隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)而降解，其降解過程為基于蛋白質(zhì)降解的死亡時(shí)間推斷提供了可靠的證據(jù)[9，14]。蛋白質(zhì)的測(cè)定和分析多采用Western 印跡、質(zhì)譜和免疫組織化學(xué)等方法[15-17]；腎、肺、肝，尤其是骨骼肌，常作為蛋白質(zhì)降解的研究對(duì)象[16]?？紤]到死后機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的影響，多指標(biāo)聯(lián)合研究可能更全面、精準(zhǔn)。LI 等[15，18]利用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)死后蛋白質(zhì)表達(dá)與死亡時(shí)間具有相關(guān)性，為死亡時(shí)間推斷提供了新思路。然而質(zhì)譜分析成本昂貴，操作流程復(fù)雜且嚴(yán)格，在一定程度上限制了其實(shí)際應(yīng)用。

2100 生物分析儀基于微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)，可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量的自動(dòng)化分析。蛋白質(zhì)230試劑盒可用于分離和分析相對(duì)分子質(zhì)量為14 000～230 000 的蛋白質(zhì)，分辨率為10%[12]，與傳統(tǒng)的SDSPAGE 相比具有易于處理、可重復(fù)性及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[11]。李文晉等[12]利用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)技術(shù)高通量、準(zhǔn)確、便捷等特性，獲取死后大鼠肝組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜，推測(cè)其與死亡時(shí)間的關(guān)系。

本研究使用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同死亡時(shí)間的蛋白質(zhì)芯片譜峰及峰含量具有差異，其變化趨勢(shì)和程度不同。PCA 是一種數(shù)據(jù)降維方法，可利用較少的綜合指標(biāo)來解釋原始變量信息[19-20]。本研究中PCA 結(jié)果顯示，死后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)譜峰分布有一定趨勢(shì)，但不能完全體現(xiàn)組間差異。OPLS 判別分析是將連續(xù)變量數(shù)據(jù)分為預(yù)測(cè)信息和不相關(guān)信息，使結(jié)果更易解釋和可視化[21]。本研究對(duì)死后不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行OPLS 判別分析發(fā)現(xiàn)，除死后6 d、7 d 和8 d 外，其余7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能與蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物類型、降解速率及個(gè)體差異等因素有關(guān)。

Fisher 判別模型按分類能力提取特征，具有很強(qiáng)的數(shù)據(jù)壓縮能力[22-23]，本研究死亡時(shí)間預(yù)測(cè)模型效果不理想，考慮Fisher 判別對(duì)線性不可分樣本無法準(zhǔn)確分類，因此需選擇更適合的數(shù)據(jù)分析方法。BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為一種應(yīng)用廣泛的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，無需具體的數(shù)學(xué)模型，同時(shí)因其良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和快速運(yùn)算能力，在解決復(fù)雜非線性關(guān)系方面具有優(yōu)勢(shì)，有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[24]。本研究中BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析僅在死后5 d 和7 d 各有1 例錯(cuò)判。對(duì)比Fisher 判別模型和BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率，BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)本研究死亡時(shí)間的預(yù)測(cè)可達(dá)到較為理想的效果，更適用于多指標(biāo)聯(lián)合推斷死亡時(shí)間的研究。

本研究對(duì)大鼠樣本進(jìn)行PCA 及OPLS 判別分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)表達(dá)譜隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)呈時(shí)序性變化，死亡時(shí)間分類預(yù)測(cè)模型具有較高準(zhǔn)確率，與李文晉等[12]前期發(fā)現(xiàn)的肝組織蛋白質(zhì)不同死亡時(shí)間變化規(guī)律相一致?；趧?dòng)物樣本分析結(jié)果，本研究收集人體骨骼肌蛋白質(zhì)樣本，發(fā)現(xiàn)不同死亡時(shí)間的芯片譜峰存在差異，譜峰含量隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化。根據(jù)譜峰含量對(duì)死亡時(shí)間進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)樣本在死后4 d 和25 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯區(qū)分，各峰含量亦隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)一定變化，說明蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)技術(shù)可應(yīng)用于動(dòng)物和人體樣本的死亡時(shí)間研究。此外，人體樣本死亡時(shí)間多在25 h 內(nèi)，時(shí)間跨度小，且受死亡原因、現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境條件和死后保存條件等多種因素影響，信息較為復(fù)雜?；诙喾矫嬉蛩氐挠绊?，本研究未能建立人體死亡時(shí)間推斷的數(shù)學(xué)模型。

綜上所述，蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、高重復(fù)性地獲取死后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物和人體骨骼肌組織相對(duì)分子質(zhì)量為14 000～230 000 的水溶性蛋白質(zhì)表達(dá)譜，結(jié)合PCA、OPLS 多維統(tǒng)計(jì)方法探索死后蛋白質(zhì)表達(dá)與死亡時(shí)間之間的變化規(guī)律，建立多種死亡時(shí)間推斷模型，其中BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)更適于多指標(biāo)聯(lián)合死亡時(shí)間推斷，可為死亡時(shí)間推斷提供新的思路和方法。本研究在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備上盡可能模擬實(shí)際情況，如設(shè)置多個(gè)死后時(shí)間點(diǎn)、增加多種死亡原因、尸體冷藏等處理方法，后續(xù)將擴(kuò)大尸體樣本的收集，完善相關(guān)信息，以期建立基于真實(shí)案例下的人體死亡時(shí)間蛋白質(zhì)信息庫。