王 慧 楊 艷 李竹茜 展曉紅 魏志平

1青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院皮膚科,青島,266109;2青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,青島,266109;3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,徐州,221002

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是一種以角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化水平的降低為特征的皮膚惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于基底細胞癌,惡性程度僅次于黑素瘤[1],目前,CSCC的治療主要有Mohs顯微外科、化療、光動力療法、放療、生物療法和免疫療法[2,3]。大多數(shù)皮膚鱗癌可通過手術(shù)成功根除,但部分皮膚鱗癌具有較高的侵襲性、轉(zhuǎn)移率和死亡率[3-6]。 EGFR/PI3K/AKT/mTOR是重要的信號通路之一,與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-9]。EGFR 及mTOR通路在分子水平存在交叉點,均與CSCC發(fā)展密切相關(guān)[10,11]。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是從吸水性鏈霉菌提取出來的一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,是mTOR特異性抑制劑[12,13],本研究以人CSCC細胞Colo-16為研究對象,觀察EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞增殖、遷移和侵襲的影響,探討其可能機制,為CSCC的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 Colo-16細胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所提供,胎牛血清來自杭州四季青生物材料有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)液來自美國Gibco公司。陰性對照質(zhì)粒shRNA-NC和EGFR shRNA質(zhì)粒由上海吉瑪制藥有限公司構(gòu)建,RAPA來自美國Sigma-Aldrich公司,細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自上海碧云天生物科技有限公司;Transwell購自美國Costar公司, Lipofectamine2000試劑來自美國Invitrogen公司,細胞增殖核抗原Ki-67(Ki-67)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、鼠抗人 β 肌動蛋白一 抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗及Western印跡法化學(xué)發(fā)光工作液均來自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細胞系構(gòu)建 復(fù)蘇凍存的人皮膚鱗癌細胞系Colo-16細胞,接種于含10%胎牛血清和青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染,24 h后以1∶10傳代,細胞貼壁后加1200 μg/mL G418篩選,連續(xù)篩選6周,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFR shRNA質(zhì)粒和shRNA-NC質(zhì)粒的Colo-16細胞。取生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)研究,分為EGFRshRNA組(EGFR shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Colo-16細胞)和陰性對照組(shRNA-NC轉(zhuǎn)染Colo-16細胞),用于后續(xù)研究。

1.3 CCK-8增殖實驗 將常規(guī)培養(yǎng)的Colo-16細胞、轉(zhuǎn)染shRNA-NC的Colo-16細胞、轉(zhuǎn)染EGFR shRNA的Colo-16細胞以1×103個/孔接種于96孔板,培養(yǎng)12 h后加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)或終濃度200 nmol/L的RAPA[14],實驗分為5組,即正常細胞組(常規(guī)培養(yǎng)的Colo-16+PBS)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染shRNA-NC質(zhì)粒的Colo-16細胞+PBS)、EGFR shRNA組(轉(zhuǎn)染EGFR shRNA質(zhì)粒的Colo-16細胞+PBS)、RAPA組(常規(guī)培養(yǎng)的Colo-16細胞+RAPA)、聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染EGFR shRNA質(zhì)粒的Colo-16細胞+RAPA)。將各組Colo-16細胞接種至96孔板中,每孔0.4×104個細胞,分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。避光條件下每孔加入CCK-8溶液20 μL,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶標儀測定各孔波長450 nm處的吸光度(A)值,代表細胞增殖活性,實驗重復(fù)3次,繪制細胞生長曲線。

1.4 克隆形成實驗 各組Colo-16細胞采用胰酶消化,制備單細胞懸液,倍數(shù)稀釋,接種6孔板,以每孔500個細胞分別培養(yǎng),培養(yǎng)至形成肉眼可見的集落,終止生長,用PBS洗滌培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定15 min,1%結(jié)晶紫染液染色10 min,顯微鏡觀察拍照,計算細胞大于10個的克隆數(shù),計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/細胞數(shù)×100%,實驗重復(fù)3次。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組Colo-16細胞密度調(diào)整為2×105/mL,接種于6孔板,待細胞完全生長融合后,用無菌槍頭均勻劃過,產(chǎn)生距離相等的劃痕,此時劃痕距離為0 h劃痕寬度。用PBS洗滌細胞,去除未貼壁細胞,然后加入培養(yǎng)基以及藥物對細胞處理24 h。此時細胞劃痕距離為24 h劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 正常細胞組、陰性對照組、RAPA組、EGFR shRNA組和聯(lián)合組細胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期,采用胰酶消化制備單細胞懸液,密度調(diào)整為2×105/mL,分別接種于含基質(zhì)膠的Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,擦去上層細胞,4%多聚甲醛固定,1%結(jié)晶紫染色液染色,于倒置相差顯微鏡下隨機選擇3個視野,計數(shù)下室染色細胞。實驗重復(fù)3次。

1.7 免疫蛋白印跡法(Western blot) 收集各組細胞,預(yù)冷PBS洗滌2次,用RIPA裂解液提取細胞總蛋白,10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗體配比濃度:Ki-67(1∶500)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)和β-actin(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBS洗滌3次,每次20 min,洗膜后分別放入用TBS 稀釋的二抗(1∶3000)1 h,PBS洗滌3次后,發(fā)光液顯影,使用Image J分析軟件計算條帶灰度值,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β肌動蛋白蛋白條帶灰度值,實驗重復(fù)3次。

1.8 半定量RT-PCR檢測 用Trizol法提取細胞總RNA,紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度,然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Premier 5.0設(shè)計引物,MMP-2正向引物序列:5′-GAACACCAGAGGAAGCCGTCAC-3′,反向引物序列:5′-AGCTGTGGACTCTAGGAGAAGGAC-3′;MMP-9正向引物序列:5'-TGGTGCAGGCAGAGTAGGAGTG-3',反向引物序列:5'-CTACACGGAGCATGGCAACGG-3';Ki-67正向引物序列:5'--GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAG-3',反向引物序列:5'--ATCTGCTTTGGAGACTCCTTA-3';內(nèi)參β肌動蛋白正向引物序列:5′-GAACGGTGAAGGTGACAG-3′,反向引物序列:5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′。PCR擴增參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,擴增40個循環(huán)。用Image J圖像分析軟件分析PCR產(chǎn)物的灰度值,實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 EGFR shRNA聯(lián)合雷帕霉素對Colo-16細胞增殖活性的影響 CCK-8實驗及克隆形成實驗顯示,EGFR shRNA組、RAPA組及聯(lián)合組Colo-16細胞吸光度A值及細胞克隆形成率均顯著低于正常細胞組及陰性對照組,吸光度A值為(0.34±0.004,0.51±0.013,0.26±0.006比0.67±0.002,0.66±0.028),克隆形成率為[(70.27±3.74)%,(78.75±3.26)%,(52.87±4.89)%比(89.48±3.74)%,(88.46±4.59)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=368.91、27.49,均P<0.05)。其中,聯(lián)合組細胞增殖活性最低,顯著低于EGFR shRNA組和RAPA組(CCK-8:q值分別為8.00、 24.40;克隆形成率:q值分別為6.03、 8.98,均P<0.05),而正常細胞組與陰性對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1,2)。

圖1 EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞增殖活性的影響

2a:正常細胞組;2b:陰性對照組;2c:EGFR shRNA組;2d:RAPA組;2e:聯(lián)合組圖2 EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞克隆形成的影響

2.2 EGFR shRNA聯(lián)合雷帕霉素對細胞遷移和侵襲能力的影響 與正常細胞組、陰性對照組比較,EGFRshRNA組、RAPA組和聯(lián)合組劃痕愈合率及侵襲細胞個數(shù)表達均顯著降低(均P<0.05)。其中,聯(lián)合組細胞劃痕愈合率及侵襲細胞個數(shù)顯著低于EGFRshRNA組、RAPA組(劃痕愈合率:q值分別為11.73、21.66,均P<0.05);侵襲細胞數(shù)目:q值分別為8.40、9.79,均P<0.05),正常細胞組與陰性對照組相比上述各蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3、4,表1)。

表1 EGFR shRNA、雷帕霉素單獨及聯(lián)合處理對Colo-16細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)的影響

3a、3f:正常細胞組;3b、3g:陰性對照組;3c、3h:EGFR shRNA組;3d、3i:RAPA組;3e、3j:聯(lián)合組圖3 EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞遷移能力的影響

4a:正常細胞組;4b:陰性對照組;4c:EGFR shRNA組;4d:RAPA組;4e:聯(lián)合組圖4 EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞侵襲能力的影響

2.3 EGFR shRNA聯(lián)合雷帕霉素對增殖、侵襲相關(guān)蛋白的影響 與正常細胞組、陰性對照組比較,雷帕霉素組、EGFR shRNA組和聯(lián)合組增殖及侵襲相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達均明顯下降,且聯(lián)合組上述蛋白表達的下降最顯著,均P<0.05,正常細胞組與陰性對照組相比上述各蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(圖5)。

5a、5c:a:與正常細胞組相比;b:與EGFRshRNA組相比;c:與RAPA組相比,均P<0.05。5b:1:正常細胞組;2:陰性對照組;3:EGFR shRNA組;4:RAPA組;5:聯(lián)合組;圖5 EGFR shRNA聯(lián)合RAPA對Colo-16細胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達的影響

3 討論

CSCC是常見的皮膚非黑素細胞惡性腫瘤,呈侵襲性生長,病情進展快,具有較強的浸潤侵襲能力,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是CSCC患者死亡的主要原因[15]。EGFR在皮膚鱗癌細胞分化、增殖、凋亡以及細胞應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,其過表達與不良預(yù)后密切相關(guān)[16]。EGFR/PI3K/AKT/mTOR信號通路是多種腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的常見通路, 參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程,也是藥物干預(yù)惡性腫瘤的潛在靶點[17-19]。由于腫瘤是多基因、多環(huán)節(jié)致病,單一基因療法往往療效欠佳, 多基因聯(lián)合治療抑癌作用較單基因治療顯著[20]。特異性靶向治療聯(lián)合化療藥物是當前腫瘤綜合治療的熱點,由于抑制mTOR會引起負反饋機制,激活上游分子,進一步活化EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路,對EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路的雙重抑制或許能夠有效避免負反饋機制,更有效增強抗腫瘤作用,可能為晚期CSCC提供新的治療思路。

失控性增殖是惡性腫瘤的基本特征。細胞增殖核抗原(Ki-67)是一種增殖細胞相關(guān)抗原,是反映細胞增殖活性的敏感指標,在多種惡性腫瘤中過表達,能夠較好地反映腫瘤的生長增殖特性[21,22],前期研究發(fā)現(xiàn)EGFR shRNA聯(lián)合RAPA增強EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路下游凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase9的表達均顯著增加,抑制增殖相關(guān)蛋白cyclin D1、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達,針對這一通路的雙重抑制有協(xié)同增效的作用[23]。本研究中,我們針對EGFR基因設(shè)計干擾質(zhì)粒EGFR shRNA,針對mTOR基因應(yīng)用其特異性抑制劑RAPA,探討EGFRshRNA聯(lián)合RAPA對皮膚鱗癌Colo-16細胞增殖、遷移和侵襲的影響,并對其可能機制進行初步探究。 CCK-8實驗、克隆形成實驗及Western blot 顯示,EGFR shRNA組、RAPA組及聯(lián)合組Colo-16細胞吸光度A值、細胞克隆形成率及Ki-67蛋白表達水平均顯著低于正常細胞組及陰性對照組,其中,聯(lián)合作用優(yōu)于EGFR shRNA或雷帕霉素單獨處理。

MMP-2和MMP-9是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,表達升高后可以誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移,其表達水平與細胞遷移、侵襲呈正相關(guān)[24,25]。劃痕實驗及Transwell小室實驗結(jié)果顯示:與正常細胞組比較,EGFRshRNA組、RAPA組和聯(lián)合組劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目及MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低(均P<0.05),其中,聯(lián)合組顯著低于EGFRshRNA組、RAPA組 。

綜上所述,本研究結(jié)果初步表明,靶向EGFRshRNA聯(lián)合化療藥物雷帕霉素在抑制CSCC細胞Colo-16的增殖、遷移和侵襲方面具有協(xié)同增效作用,推測其機制可能與雙重抑制EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)。這一結(jié)果證明靶向基因治療和化療藥物聯(lián)合治療方法的可行性,為CSCC的治療提供新思路,但由于本研究聯(lián)合用藥的結(jié)果僅基于體外細胞實驗,聯(lián)合用藥的療效還有待動物和臨床試驗的進一步研究和驗證。