何春曉 錢(qián)瑩寬 沈雅敏 李經(jīng)歷 曹淼英

胸腔積液是晚期肺癌患者的常見(jiàn)體征，任何一種病理類(lèi)型的肺癌都可以引起胸腔積液，其中最常見(jiàn)的是肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）[1]。晚期肺癌患者有時(shí)較難獲取組織學(xué)標(biāo)本，抽取胸腔積液行細(xì)胞學(xué)檢查相對(duì)容易，因此對(duì)于有胸腔積液的肺癌患者，胸水細(xì)胞蠟塊檢測(cè)可作為診斷肺癌病理類(lèi)型和指導(dǎo)臨床治療的主要手段[2]。與組織學(xué)檢查相比，胸水細(xì)胞蠟塊檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確性較低，因此需要更加敏感的檢測(cè)指標(biāo)用以提高個(gè)體化治療和預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。中電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道蛋白（intermediate-conduc‐tance Ca2+-activated K+channel，KCa3.1）已被證實(shí)在多種腫瘤中高表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。但KCa3.1 在晚期LUAD 患者中的作用尚未有相關(guān)文獻(xiàn)闡述。本研究通過(guò)檢測(cè)LUAD 伴惡性胸腔積液患者胸水細(xì)胞蠟塊KCa3.1 表達(dá)水平，分析其與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，探索其促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的可能機(jī)制，從而為晚期LUAD 伴惡性胸腔積液患者的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析 從GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取483 例LUAD 組織和347 例正常肺組織數(shù)據(jù)，比較LUAD 組織和正常肺組織KCa3.1 表達(dá)水平。利用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析LUAD 組織KCa3.1 表達(dá)水平與腫瘤分期、總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系。根據(jù)KCa3.1 表達(dá)水平的中位數(shù)將患者分為KCa3.1 高表達(dá)組及低表達(dá)組。

1.2 對(duì)象 選取2019 年6 月1 日至2021 年6 月30 日紹興市人民醫(yī)院收治的LUAD 伴惡性胸腔積液患者72 例，其中男27 例，女45 例；年齡43～91 歲，中位年齡69 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18 歲；（2）已行胸腔穿刺術(shù)的LUAD 患者，且其胸腔積液中找到腺癌細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色考慮肺來(lái)源；（3）所有患者均未接受過(guò)任何治療，如放化療、抗結(jié)核、抗感染、使用免疫抑制劑等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時(shí)合并其他腫瘤；（2）不能遵守本方案研究步驟。本研究經(jīng)紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：2019-K-Y-133-02），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 所有患者行胸腔穿刺術(shù)取250 ml 以上胸腔積液，靜止沉淀1 h，然后吸取底部液體置入離心管中，加入10%甲醛5 ml，2 500 r/min離心5 min，去除上清液，再加入10%甲醛5 ml，2 500 r/min離心5 min，重復(fù)1 次并靜置，待取材時(shí)用濾紙包裹，通過(guò)脫水、浸蠟、包埋制成細(xì)胞蠟塊。

1.3.2 試劑和儀器 兔抗人KCa3.1 抗體（批號(hào)：23271-1-AP）購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司；免疫組化3，3-二氨基苯聯(lián)胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（批號(hào)：UM-9002）和全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（型號(hào)：Ultra PATH ZZSGB-BIO）均購(gòu)于中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；顯微圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)：DM2000）購(gòu)于德國(guó)徠卡公司。

1.3.3 胸水細(xì)胞蠟塊中KCa3.1 的表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組化En Vision 染色。將已脫水脫鈣包埋好的蠟塊3～5 μm 厚度連續(xù)切片，60 ℃烤片120 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇去二甲苯，蒸餾水水化。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 8.0）高壓修復(fù)抗原，3% H2O2降低過(guò)氧化氫酶造成的非特異性背景染色，PBS 浸泡，10%山羊血清封閉20 min后，滴加兔抗人KCa3.1 抗體（1∶200）4 ℃孵育過(guò)夜，以PBS 作陰性對(duì)照。37 ℃復(fù)溫40 min，PBS 洗滌。滴加HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（即用型），室溫孵育30 min，PBS 洗滌后DAB 顯色，顯微鏡下判斷染色情況，蒸餾水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，促藍(lán)液返藍(lán)，脫水、透明、封片后顯微圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.3.4 結(jié)果判定 由2 位病理醫(yī)師在未知腫瘤級(jí)別的情況下進(jìn)行雙盲閱片。每例鏡下隨機(jī)采集10 個(gè)視野，觀察并記錄細(xì)胞染色強(qiáng)度，其中無(wú)染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；記錄鏡下陽(yáng)性細(xì)胞百分比，其中鏡下陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜5%為0 分，5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。細(xì)胞染色強(qiáng)度和鏡下陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分相乘為最終得分，≤6 分為低表達(dá)，＞6 分為高表達(dá)。分析胸水細(xì)胞蠟塊中KCa3.1 表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。

1.4 隨訪(fǎng)和生存分析 采用門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)，末次隨訪(fǎng)時(shí)間為2022 年6 月30 日。OS 定義為患者自診斷為L(zhǎng)UAD 開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。LUAD組織和正常肺組織KCa3.1 表達(dá)水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不同腫瘤分期患者KCa3.1 表達(dá)水平比較采用單因素方差分析。KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者臨床特征比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 LUAD 組織和正常肺組織KCa3.1 表達(dá)水平比較 生物信息學(xué)分析提示，LUAD 組織KCa3.1表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 LUAD 組織和正常肺組織KCa3.1 表達(dá)水平比較

2.1.2 不同腫瘤分期患者KCa3.1 表達(dá)水平比較 不同腫瘤分期患者KCa3.1 表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.335，P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同腫瘤分期患者KCa3.1 表達(dá)水平比較

2.1.3 KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者OS 比較 KCa3.1高表達(dá)患者OS 低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示KCa3.1 高表達(dá)可能導(dǎo)致LUAD 的預(yù)后較差，見(jiàn)圖3。

圖3 KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者OS 比較

2.2 臨床資料分析

2.2.1 胸水細(xì)胞蠟塊KCa3.1 的表達(dá)情況 免疫組化染色顯示，胸水細(xì)胞蠟塊中腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有KCa3.1 表達(dá)，見(jiàn)圖4。圖4A 中＞75%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)、完整、均勻的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色；圖4B 中＜50%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色。

圖4 胸水細(xì)胞蠟塊中KCa3.1 的表達(dá)（A：KCa3.1 高表達(dá)；B：KCa3.1 低表達(dá)）

2.2.2 KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者臨床特征比較KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者性別、年齡、吸煙情況、T分期、N 分期、肺外轉(zhuǎn)移情況、表皮生長(zhǎng)因子受體（epi‐dermal growth factor receptor，EGFR）基因突變情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 KCa3.1高表達(dá)和低表達(dá)患者臨床特征比較

2.2.3 KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者生存情況比較KCa3.1 高表達(dá)患者中位OS 為6.5 個(gè)月（95%CI：4.9～8.1個(gè)月），KCa3.1 低表達(dá)患者中位OS 為8.6 個(gè)月（95%CI：7.3～9.8 個(gè)月），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 KCa3.1 高表達(dá)和低表達(dá)患者生存情況比較

3 討論

晚期LUAD 患者往往伴有惡性胸腔積液，因其一般情況通常較差等原因可能已完全喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，也不能耐受肺粗針穿刺或支氣管鏡活檢等檢查。胸水細(xì)胞蠟塊檢測(cè)具有容易獲得、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，是病理學(xué)診斷的可選方法。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)胸水細(xì)胞蠟塊和腫瘤組織檢測(cè)程序性死亡受體-配體1（pro‐grammed cell death-ligand 1，PD-L1）、EGFR 基因的表達(dá)水平結(jié)果一致[5-7]，因此對(duì)于無(wú)法獲得腫瘤組織樣本的晚期LUAD 患者，可以通過(guò)胸水細(xì)胞蠟塊檢測(cè)腫瘤相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志為腫瘤的個(gè)體化治療和預(yù)后判斷提供幫助。

KCa3.1，又稱(chēng)KCNN4、SK4、IKCa1，是鈣激活鉀離子通道家族中的一員。它由Ishii 等[8]發(fā)現(xiàn)，KCa3.1 基因位于第19 號(hào)染色體（19q13.2），由同源四聚體組成1個(gè)有功能的KCa3.1 蛋白，該通道在結(jié)構(gòu)上擁有6個(gè)跨膜區(qū)域（S1～S6），S5 與S6 中間有一段內(nèi)陷的疏水序列形成通透離子的孔道，其中高度保守的“GYG”氨基酸標(biāo)志性序列對(duì)K+有較高的選擇性，該通道蛋白的C-末端連接鈣調(diào)蛋白，為該通道對(duì)鈣敏感性調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并進(jìn)行調(diào)控[9]。KCa3.1 表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各個(gè)器官組織，如腦、心、肺、胃腸道、前列腺、子宮、乳腺、造血組織等，參與調(diào)節(jié)侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期進(jìn)程、氧耗氧代謝、DNA 損傷反應(yīng)和細(xì)胞死亡等多種細(xì)胞過(guò)程，因此在體內(nèi)的組織纖維化、細(xì)胞增生、內(nèi)外分泌腺的分泌等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)KCa3.1 在多種腫瘤如結(jié)直腸癌[11]、胰腺癌[12]等中呈現(xiàn)高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)GE‐PIA 對(duì)KCa3.1 基因在LUAD 中的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)LUAD 患者KCa3.1 表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，并通過(guò)免疫組化法檢測(cè)到紹興市人民醫(yī)院LUAD 伴惡性胸腔積液患者胸水細(xì)胞蠟塊細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有KCa3.1 的表達(dá)，提示KCa3.1 可能對(duì)LUAD 的發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)作用。

Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)KCa3.1 高表達(dá)患者OS 低于低表達(dá)患者。但是該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LUAD的分析主要針對(duì)早中期可手術(shù)患者，對(duì)晚期患者的數(shù)據(jù)相對(duì)較少。本研究以L(fǎng)UAD 伴惡性胸腔積液的患者為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KCa3.1 高表達(dá)的LUAD 患者預(yù)后不佳，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致。目前在其他癌癥中已發(fā)表的相關(guān)研究結(jié)果也提示KCa3.1 高表達(dá)與腫瘤不良預(yù)后有關(guān)。Du 等[12]在胰腺導(dǎo)管腺癌患者中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)KCa3.1 與較差的總體生存率顯著相關(guān)。Li 等[13]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中具有高KCa3.1 表達(dá)的患者表現(xiàn)出較短的無(wú)病生存期。Chen等[14]通過(guò)綜合生物信息學(xué)分析篩選和鑒定黑色素瘤的潛在生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)KCa3.1 與CDH3、ESRP1、FGF2、GBP2、KIT、SEMA4D 和ZEB1 一起作為樞紐基因，被認(rèn)為與黑色素瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。Chen 等[15]發(fā)現(xiàn)KCa3.1 在腎透明細(xì)胞癌組織中高度表達(dá)，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并推測(cè)KCa3.1 可能通過(guò)影響腫瘤免疫微環(huán)境來(lái)影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后。由此可見(jiàn)，KCa3.1可能是腫瘤預(yù)后不良因素，可作為L(zhǎng)UAD 預(yù)后相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LUAD 患者KCa3.1 表達(dá)水平明顯增高，其中高表達(dá)患者OS 相對(duì)較低，提示KCa3.1 可能是影響LUAD 預(yù)后的危險(xiǎn)因素，并為L(zhǎng)UAD患者的診斷和預(yù)后判斷提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。但由于本實(shí)驗(yàn)納入樣本量較少，研究結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)其具體作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。