李志軍 汪飛 劉娟 葉芃

盡管近年來(lái)急性肺損傷的診療技術(shù)不斷更新，但是急性肺損傷死亡率仍高達(dá)70%～90%[1]，因此，臨床急需尋求一種更加積極有效的治療手段。大黃是一種具有多種藥理作用的傳統(tǒng)草藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)大黃具有抗炎、降低腸黏膜通透性、防止細(xì)菌易位和調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用[2]。本研究通過(guò)氣道內(nèi)滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立急性肺損傷小鼠模型，觀察大黃干預(yù)前后小鼠腸道菌群多樣性和豐度的變化以及大黃干預(yù)對(duì)Th17/調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的影響，探討大黃保護(hù)急性肺損傷小鼠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)4～6 周齡C57BL/6 小鼠36只，體質(zhì)量（25.0±1.0）g，由上海Slake 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)為20170005036437，使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2014-0008。小鼠飼養(yǎng)條件：每天12 h 的光照，溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：2019-034）。

1.2 主要試劑及儀器 大黃由浙江醫(yī)院中藥房提供，20 g 中藥大黃加入1 L 水中，大火煮沸，轉(zhuǎn)至文火煎煮2 h。煎煮兩次并收集藥液，轉(zhuǎn)移至旋蒸儀80 r/min，減壓回收至干燥，稱取600 mg 大黃干燥品溶于100 ml 0.9%氯化鈉溶液中制備6 mg/ml 流浸膏母液。曲古抑菌素A（批號(hào)：V900931，德國(guó)Sigma 公司）；丙戊酸（批號(hào)：PHR1061，德國(guó)Sigma 公司）；血清組蛋白乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）9-ELISA試劑盒（批號(hào)：CSBEL010245MO，武漢華美）；HDAC6-ELISA試劑盒（批號(hào)：CSB-EL010242MO，武漢華美）；PE 標(biāo)記叉盒蛋白3（forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3）流式抗體（批號(hào)：12-5773-82，美國(guó)eBioscience 公司）；FITC 標(biāo)記CD4 流式抗體（批號(hào)：11-0042-82，美國(guó)eBioscience 公司）；PE 標(biāo)記IL-17A 流式抗體（批號(hào)：12-7177-81，美國(guó)eBiosci‐ence 公司）；QIAamp DNA 糞便試劑盒（批號(hào)：51604，德國(guó)Qiagen 公司）；QIAquick PCR 純化試劑盒（批號(hào)：28106，德國(guó)Qiagen 公司）；MiSeq 基因測(cè)序試劑盒v3（批號(hào)：MS-102-3001，美國(guó)Illumina 公司）；正置顯微鏡（型號(hào)：Leica DM6 B，德國(guó)Laica 公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：SpectraMax M4，美國(guó)Molecular Devices）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：NovoCyte 2040R，中國(guó)艾森公司）；GeneAmp PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)：9700，美國(guó)ABI 公司）；MiSeq 測(cè)序儀（型號(hào)：PE300，美國(guó)San Diego 公司）。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 采用隨機(jī)抽簽法將36 只小鼠分為正常對(duì)照組、急性肺損傷組、曲古抑菌素A 組、丙戊酸組、低劑量大黃組、高劑量大黃組，每組6 只。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用氣管內(nèi)滴注LPS 溶液（LPS 用0.9%氯化鈉溶液配置，濃度為3 mg/kg，劑量按小鼠體重1 μl/g），建立急性肺損傷小鼠模型；正常對(duì)照組氣管內(nèi)滴注等體積0.9%氯化鈉溶液。造模24 h后分別采取相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)，急性肺損傷組：腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液（25 ml/kg）；低劑量大黃組：胃部灌注50 mg/kg 大黃流浸膏（大黃流浸膏母液稀釋至2 mg/ml，25 ml/kg）進(jìn)行治療；高劑量大黃組：胃部灌注150 mg/kg 大黃流浸膏（大黃流浸膏母液6 mg/ml，25 ml/kg）進(jìn)行治療；曲古抑菌素A 組：腹腔注射曲古抑菌素A（1 mg/kg，4 mg 溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中，25 ml/kg）；丙戊酸組：腹腔注射丙戊酸（200 mg/kg，80 mg溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中，25 ml/kg）；正常對(duì)照組：腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液（25 ml/kg）。藥物連續(xù)治療5 d，1 次/d。

1.4 樣本收集 最后1次給藥后24 h處死小鼠，收集外周血、肺組織、脾臟組織以及糞便樣本以供后續(xù)檢測(cè)。

1.5 肺組織病理學(xué)檢查 采用HE 染色。取右肺中葉10%甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯處理后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 肺組織濕/干（wet/dry，W/D）比值檢測(cè) 肺組織W/D 比值可反映肺水腫程度，小鼠處死后取出左肺擦干，稱重確定濕重，然后在80 ℃下烤箱烤48 h 后確定干重，計(jì)算W/D 比值。

1.7 肺組織及血清中HDAC9 和HDAC6 水平檢測(cè) 將肺組織碾磨獲得組織勻漿，用PBS 稀釋5 次，而后和血清一起分別以3 000 r/min，離心15 min，獲取上清液。按照HDAC9-ELISA 試劑盒和HDAC6-ELISA 試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)肺組織和外周血中HDAC9和HDAC6水平。

1.8 Th17/Treg 檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取新鮮小鼠脾臟，經(jīng)組織研磨并經(jīng)過(guò)200 目篩網(wǎng)，500 r/min 離心15 min，收集沉淀細(xì)胞，加入5 μl FITC-CD4 流式抗體，4 ℃孵育30 min，再用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，500 r/min離心5 min，棄上清液；加入5 μl PE-FOXP3 流式抗體，室溫避光孵育3 h，加入1 ml PBS 1 000 r/min 離心5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg 細(xì)胞。另取一部分細(xì)胞接種于24 孔板內(nèi)，加入1 ml 含10% FBS 的1640 培養(yǎng)基，在加入1 μl 佛波酯和1 μl 離子霉素，震蕩混勻后置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，再加入2 μl 布雷非德菌素A，混勻后置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3.5 h，再分別加入FITC-CD4 和PE-IL-17A 流式抗體進(jìn)行孵育，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17。并計(jì)算Th17/Treg比值。

1.9 腸道菌群檢測(cè) 采用細(xì)菌16S 核糖體DNA（rD‐NA）高通量測(cè)序技術(shù)。使用QIAamp DNA 糞便試劑盒提取糞便樣本中細(xì)菌DNA。采用GeneAmp PCR Sys‐tem 9700 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增微生物16S rDNA 的V3～V4區(qū)。委托上海生工生物技術(shù)公司合成PCR 引物（上游引物：5'-CTACGGGNGGCWGCAG-3'；下游引物：5'-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），PCR 體積為5 μl，包含0.1 單位的Taq 聚合酶，10 ng 擴(kuò)增基因組DNA，每個(gè)PCR 引物2.5 pmol 和2.5 pmol 的dNTP。循環(huán)周期如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃再變性15 s，72 ℃延長(zhǎng)1 min。整個(gè)過(guò)程重復(fù)40 個(gè)周期，然后在72 ℃下最后延伸10 min。使用QIAquick PCR 純化試劑盒回收和純化PCR 產(chǎn)物，將其加入MiSeq 基因測(cè)序試劑盒v3，用PE300 MiSeq 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.10 腸道菌群分析

1.10.1 操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析 使用Usearch 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類分析，按照97%相識(shí)度的標(biāo)準(zhǔn)聚類原則獲得OTU，最后將所有測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)OTU 序列，提取匹配的物種信息。

1.10.2 α 和β 多樣性分析 α 多樣性分析（物種積累曲線和Observed spieces 指數(shù)）用于評(píng)估腸道菌群的豐富度和多樣性，物種積累曲線用于衡量和預(yù)測(cè)群落中物種豐富度隨樣本量擴(kuò)大而增加的幅度來(lái)反映抽樣的充分性；Observed spieces 指數(shù)用來(lái)反映組內(nèi)物種豐度情況。β 多樣性分析不同類群間的物種多樣性差異性，通過(guò)樣本間距離計(jì)算及主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）各組之間物種分布差異。

1.10.3 腸道菌群差異性分析 從各個(gè)OUT 中挑選出豐度最高的序列與已知的物種16S 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)每個(gè)OUT 進(jìn)行物種歸類。分別在門(mén)、綱、目、科、屬層面對(duì)物種進(jìn)行分析，觀察樣本間的聚類關(guān)系以及物種組成差異。最后采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)大?。↙EfSe）分析來(lái)估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用R語(yǔ)言分析腸道菌群。

2 結(jié)果

2.1 6 組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化比較 相對(duì)于正常對(duì)照組，急性肺損傷組小鼠肺組織肺泡間隔增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯加重，使用相應(yīng)劑量的藥物干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)6 組小鼠肺組織損傷狀況均有不同程度緩解，見(jiàn)圖1。

圖1 6組小鼠肺組織病理切片所見(jiàn)（A：正常對(duì)照組；B：急性肺損傷組；C：曲古抑菌素A 組；D：丙戊酸組；E：低劑量大黃組；F：高劑量大黃組）

2.2 6 組小鼠肺組織W/D 比值比較 與正常對(duì)照組比較，急性肺損傷組W/D 比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而經(jīng)過(guò)治療后，與急性肺損傷組比較，其他4 組W/D 比值均有不同程度降低（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 6組小鼠肺組織W/D 比值比較

2.3 6組小鼠肺組織及血清中HDAC6、HDAC9 水平比較 與正常對(duì)照組比較，其他5 組小鼠血清中HDAC6 水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與急性肺損傷組比較，曲古抑菌素A 組、低劑量大黃組和高劑量大黃組小鼠血清中HDAC6 水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。6組小鼠肺組織HDAC6、HDAC9 水平及血清HDAC9 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 6組小鼠肺組織及血清中HDAC6、HDAC9水平比較（pg/ml）

2.4 6組小鼠脾臟組織中Th17/Treg 比值比較 與正常對(duì)照組比較，急性肺損傷組、曲古抑菌素A 組和丙戊酸組Treg 數(shù)量增加，Th17 數(shù)量減少，Th17/Treg 比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與急性肺損傷組比較，曲古抑菌素A 組、丙戊酸組、低劑量大黃組和高劑量大黃組Treg 數(shù)量減少，低劑量大黃組和高劑量大黃組Th17 數(shù)量增加，丙戊酸組、低劑量大黃組和高劑量大黃組Th17/Treg 比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 6組小鼠脾組織中Treg、Th17 數(shù)量及Th17/Treg 比值比較

2.5 大黃對(duì)急性肺損傷小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 α 多樣性分析與β 多樣性分析結(jié)果 α 多樣性分析提示隨著曲線增加到平臺(tái)，物種數(shù)量沒(méi)有明顯增加，表明本研究樣本量足以反映物種豐度，樣本量的擴(kuò)容不能增加物種的豐度及多樣性（圖2A、B，見(jiàn)插頁(yè)）。β 多樣性分析首先計(jì)算任意兩個(gè)樣本間的距離從而獲得樣本距離矩陣（圖2C，見(jiàn)插頁(yè)）；PCoA 提示PCoA1 55.33%，PCoA2 20.24%，提示不同類群間的物種多樣性差異（圖2D，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖2 腸道菌群的α 和β 多樣性分析（A：物種積累曲線；B：物種豐度指數(shù)；C：樣本距離熱圖：基于β 多樣性分析計(jì)算任意兩個(gè)樣本間的距離；D：主坐標(biāo)分析：基于歐式距離主坐標(biāo)分析提示PCoA1 55.33%，PCoA2 20.24%）

2.5.2 各組各個(gè)層面菌群分布差異比較 韋恩圖提示6 組共有21 個(gè)OTU，每組都有自己獨(dú)特的OTU（圖3A，見(jiàn)插頁(yè)）。腸道菌群主要由厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)等組成，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)占細(xì)菌總數(shù)的86%。在綱水平上，擬桿菌綱和梭狀桿菌綱最常見(jiàn)；在目級(jí)上，擬桿菌目和乳酸桿菌目最豐富。此外，低劑量大黃處理抑制了厭氧菌，但對(duì)乳酸桿菌和梭狀桿菌的豐度均無(wú)明顯影響，在屬水平上高劑量大黃有效促進(jìn)了乳酸桿菌的增殖（圖3B，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖3 不同組別腸道菌群不同層面差異性分析（A：韋恩圖顯示各組OTU 的異同；B：Tax 分配樹(shù)用于顯示腸道菌群從門(mén)到屬的進(jìn)化關(guān)系；C：LEfSe 用于篩選組間顯著差異物種；D：選擇前15 個(gè)物種進(jìn)行相關(guān)性分析；厚壁菌門(mén)包括阿利斯蒂普菌、玫瑰桿菌、醋酸桿菌、梭狀桿菌、Oscillibacter、腸桿菌、丁酸桿菌和乳酸桿菌；擬桿菌門(mén)包括擬桿菌門(mén)和類副桿菌門(mén)）

2.5.3 各組腸道菌群差異物種的相關(guān)性分析 LEfSe分析用于篩選各組間的差異細(xì)菌（圖3C，見(jiàn)插頁(yè)）。前15 名細(xì)菌被納入厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相關(guān)性分析，其中厚壁菌門(mén)包括阿利斯蒂普菌、玫瑰桿菌、醋酸桿菌、梭狀桿菌、Oscillibacter、腸桿菌、丁酸桿菌和乳酸桿菌，擬桿菌門(mén)包括擬桿菌和類副桿菌。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在不同水平上呈負(fù)相關(guān)，在同一門(mén)內(nèi)呈正相關(guān)。低劑量大黃處理在屬水平上促進(jìn)了阿利斯蒂普菌的生長(zhǎng)，從而抑制了擬桿菌在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。高劑量大黃增加了腸道內(nèi)單胞菌的生長(zhǎng)，這有助于梭狀桿菌和乳酸桿菌的增殖，并在屬水平上減少類桿菌的增殖，這表明高劑量大黃通過(guò)促進(jìn)急性肺損傷小鼠梭狀桿菌和乳酸桿菌增殖而抑制類桿菌生長(zhǎng)（圖3D，見(jiàn)插頁(yè)）。

3 討論

急性肺損傷是臨床常見(jiàn)的危重癥，如不及時(shí)干預(yù)，極有可能向急性呼吸窘迫綜合征發(fā)展，預(yù)后不佳。本研究采用氣道內(nèi)滴注LPS 建立急性肺損傷動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織肺泡間隔增厚、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織W/D 比值升高，這與既往研究結(jié)果相符[3]。Liu 等[2]研究發(fā)現(xiàn)抑制HDAC6 表達(dá)，可以阻斷NF-κB 激活以及下游IκB 磷酸化，減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺組織炎癥。但也有研究得出不一樣的結(jié)論。Menden 等[4]指出抑制HDAC6 表達(dá)能促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的急性肺部炎癥。Zhang 等[5]報(bào)道煙霧吸入誘導(dǎo)急性肺損傷后，支氣管肺泡灌洗液中Th17/Treg 比值升高，而且Th17/Treg 比值與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究與上述研究結(jié)果略有不一致，與正常對(duì)照組比較，急性肺損傷組小鼠血清中HDAC6 水平升高，脾臟組織中Th17/Treg 比值降低。高劑量大黃治療后，血清中HDAC6 水平升高，Treg 數(shù)量減少，Th17 數(shù)量增加，從而恢復(fù)了脾臟Th17/Treg 細(xì)胞平衡。有以下幾個(gè)原因可以解釋研究發(fā)現(xiàn)上的差異：（1）由于外周血中缺乏Treg，本研究采用脾臟組織檢測(cè)Th17、Treg。為了減輕急性肺損傷肺部劇烈的炎癥反應(yīng)，Treg 在肺組織中消耗過(guò)多，然后在脾臟中大量增殖以補(bǔ)充消耗的Treg，從而引起脾臟組織中Treg 增多。（2）高劑量大黃干預(yù)后提高血清中HDAC6 水平，誘導(dǎo)Th17 產(chǎn)生，恢復(fù)脾臟Th17/Treg 細(xì)胞平衡，減輕急性肺損傷小鼠肺組織病理?yè)p傷，為大黃免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了證據(jù)。

肺-腸軸理論指的是腸道菌群失衡引起肺部炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致一系列呼吸系統(tǒng)疾患，中藥大黃具有通腑泄下的作用，筆者推測(cè)大黃恢復(fù)急性肺損傷小鼠Th17/Treg 細(xì)胞平衡，減輕肺組織損傷可能同調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂有關(guān)。筆者利用16S rDNA 測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小鼠腸道菌群的組成及豐度，發(fā)現(xiàn)急性肺損傷組小鼠擬桿菌門(mén)豐度增加，厚壁菌門(mén)豐度降低。這些結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致。Li 等[6]也發(fā)現(xiàn)在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中厚壁菌門(mén)減少。因此，由厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)失衡導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)可能加重急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)。此外，筆者也發(fā)現(xiàn)大黃能部分改善急性肺損傷腸道菌群紊亂，有助于厚壁菌門(mén)的菌群增殖，在屬水平上增加了阿利斯蒂普菌、梭狀桿菌和乳酸桿菌，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，發(fā)揮了抗炎作用。這與以往的報(bào)道相一致，Neyrinck 等[7]研究發(fā)現(xiàn)大黃能增加腸道雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量，恢復(fù)腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，從而緩解酒精誘導(dǎo)肝損傷。據(jù)報(bào)道阿利斯蒂普菌、梭狀桿菌和乳酸桿菌都是產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的細(xì)菌，SCFA 是HDAC 抑制劑，能夠促進(jìn)Treg 分化，維持Th17/Treg 細(xì)胞平衡和調(diào)節(jié)促炎、抑炎因子釋放。Li 等[8]采用銅綠假單胞菌誘導(dǎo)大鼠肺部急性炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)腸道阿利斯蒂普菌的豐度降低，黃芩甙干預(yù)后能改善腸道菌群紊亂。Li 等[9]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充梭狀桿菌能增加脾組織及外周淋巴組織Treg 數(shù)量，從而減輕卵蛋白引起的氣道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，急性肺損傷時(shí)伴腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)為厚壁菌門(mén)減少，擬桿菌門(mén)升高，導(dǎo)致Th17/Treg 細(xì)胞失衡。大黃通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，在屬水平上促進(jìn)了阿利斯蒂普菌、梭狀桿菌和乳酸桿菌的增殖，提升血清中HDAC6 水平，恢復(fù)Th17/Treg 細(xì)胞平衡，從而發(fā)揮保護(hù)LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠的作用。