趙寧生 胡勇 鄭玲

急性肺損傷是由多種致病因素引發(fā)的一種嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)綜合征[1]，臨床上表現(xiàn)為呼吸困難、血液低氧、皮膚黏膜發(fā)紺、呼吸頻率增加等癥狀，發(fā)展到嚴(yán)重階段可引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征[2]。目前臨床上治療手段以藥物和輔助呼吸治療為主。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在其中凸顯出了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，受到了越來越多的關(guān)注。中醫(yī)學(xué)將急性肺損傷歸為邪毒入侵導(dǎo)致的痰飲淤積，治療以祛邪兼扶正的方法[3]。中藥大黃屬于蓼科大黃屬的多年生植物，具有瀉下攻積、清利濕熱、涼血解毒、祛瘀等功效[4]。大黃酸是大黃的主要有效成分，有抗菌、抗炎、治療糖尿病和腎病等作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸對(duì)改善肺損傷具有一定的積極作用[6]。NF-κB信號(hào)通路是與炎癥相關(guān)的經(jīng)典通路之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)的作用[7]。有研究報(bào)道抑制NF-κB 信號(hào)通路對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用[8]。LPS 是由脂質(zhì)和多糖組成的內(nèi)毒素，研究發(fā)現(xiàn)LPS 能夠引起肺泡上皮細(xì)胞損傷并誘導(dǎo)其發(fā)生炎性反應(yīng)[9]。因此本研究選擇LPS 誘導(dǎo)人肺泡上皮A549 細(xì)胞作為急性肺損傷細(xì)胞模型，探討大黃酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的炎癥損傷肺泡上皮細(xì)胞增殖和遷移的影響以及NF-κB 信號(hào)通路的作用，為大黃酸應(yīng)用于急性肺損傷的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人肺泡上皮細(xì)胞A549 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥品、試劑與儀器 大黃酸（批號(hào)：T06J10F92311）、NF- κB 信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082（批號(hào)：J07HS173399）和LPS（批號(hào)：J07HS174755）均購自上海源葉生物科技有限公司；NF-κB 信號(hào)通路激活劑佛波酯（phorbol 12- myristate 13- acetate，PMA）（批號(hào)：0000112801）購自美國Sigma-Aldrich 公司；FBS（批號(hào)：2176404）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；F-12K 培養(yǎng)基（批號(hào)：20220617）購自北京索萊寶生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：051322220531）、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號(hào)：2321220429）均購自上海碧云天生物科技有限公司；IL-6 ELISA 檢測試劑盒（批號(hào)：Feb2022/Mar2022）、IL-1β ELISA 檢測試劑盒（批號(hào)：Mar2022）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell count kit-8，CCK-8）（批號(hào)：C6205060）購自上海翌圣生物科技有限公司；鼠抗人磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）（批號(hào)：09）購自美國CST 公司；鼠抗人[NF-κB p65（批號(hào)：10021394）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）（批號(hào)：10004552）、細(xì)胞周期素D1（Cy‐clin D1）（批號(hào)：10016419）、β-actin（批號(hào)：10021787）]及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（批號(hào)：20000374）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；MCO18AIC 型二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本三洋電機(jī)公司；XSP-63XDV 型光學(xué)倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器一廠；FlexStation 3 型多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices 公司；FluorChem HD2 型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Proteinsimple 公司等。

1.3 方法

1.3.1 A549 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549 細(xì)胞培養(yǎng)于F-12K 培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青-鏈霉素）中，待細(xì)胞貼壁后密度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第3 代對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，環(huán)境條件維持37 ℃，5% CO2。

1.3.2 分組及干預(yù) 體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞分為對(duì)照組（不做干預(yù)）、模型組（以10 μg/ml LPS 刺激A549 細(xì)胞24 h 構(gòu)建體外急性肺損傷細(xì)胞模型[10]），LPS+2、4、8 μmol/L 大黃酸組（在模型組的基礎(chǔ)上分別加入2、4、8 μmol/L 大黃酸進(jìn)行藥物干預(yù)），采用ELISA 法測定炎癥因子IL-6、IL-1β 的表達(dá)水平，CCK-8 法測定細(xì)胞活力，篩選出炎癥因子和細(xì)胞活力與模型組比較均顯著變化的最小大黃酸濃度（2 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、大黃酸組、BAY 11-7082 組、抑制劑組和激活劑組。其中對(duì)照組不做干預(yù)，模型組以10 μg/ml LPS 進(jìn)行干預(yù)，大黃酸組在模型組的基礎(chǔ)上加2 μmol/L 大黃酸進(jìn)行干預(yù)，BAY 11-7082 組在模型組的基礎(chǔ)上加5 μmol/L BAY 11-7082 進(jìn)行干預(yù)[11]，抑制劑組在大黃酸組的基礎(chǔ)上加5 μmol/L BAY 11-7082 進(jìn)行干預(yù)，激活劑組在大黃酸組的基礎(chǔ)上加1 μmol/L PMA 進(jìn)行干預(yù)[12]，后置于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.3 A549 細(xì)胞中IL-6、IL-1β 水平檢測 采用ELI‐SA 法。收集藥物干預(yù)24 h 后的細(xì)胞，利用超聲對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，離心后吸取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測定IL-6、IL-1β 水平。

1.3.4 A549 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8 法。取LPS干預(yù)24 h 的細(xì)胞，調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml，將其接種到96 孔板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μl ，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物干預(yù)24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μl 孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測定各組450 nm 波長處吸光度（opti‐cal density，OD）值，每組檢測3 次。細(xì)胞活力（%）=OD（模型組或10 μg/ml LPS+2、4、8 μmol/L 大黃酸組-空白組）/OD（對(duì)照組-空白組）×100%。

1.3.5 A549 細(xì)胞增殖率檢測 采用EdU 法。取各藥物干預(yù)24 h 的細(xì)胞，進(jìn)行EdU 處理，去除培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛0.5 ml 處理15 min，用0.5 ml 3% BSA 洗滌，重復(fù)3 次，接著用0.5 ml 0.3% TritonX-100 去除殘留的BSA，室溫下處理10 min，再進(jìn)行3 次洗滌；使用12 孔板，每孔加入200 μl Click 反應(yīng)液后室溫下避光孵育30 min，洗滌3 次；加入Hoechst 處理10 min，再進(jìn)行3 次洗滌后裝片，使用熒光顯微鏡拍照，使用Image J圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理。EdU 陽性染色細(xì)胞（紅色）占總細(xì)胞（藍(lán)色）的百分比表示細(xì)胞增殖率。

1.3.6 A549 細(xì)胞遷移數(shù)檢測 采用Transwell 小室法。細(xì)胞分組與給藥方法同1.3.2，用無血清培養(yǎng)基將各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為3×105個(gè)/ml，取Transwell 小室，在上室中加入0.2 ml 細(xì)胞懸液，下室加入0.5 ml 含10% FBS 的培養(yǎng)基。24 h 后，棄上清液，擦去上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定20 min 后晾干，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 清洗3 次，晾干。將Transwell小室置于顯微鏡上，每孔隨機(jī)選5 個(gè)不同區(qū)域，用顯微鏡觀察拍照。每孔隨機(jī)選5 個(gè)不同區(qū)域。使用Image J圖像分析軟件計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.3.7 A549 細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Cas‐pase-1 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。收集藥物干預(yù)24 h 的細(xì)胞，提取蛋白并進(jìn)行定量后上樣，跑電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，參照抗體說明書加入相應(yīng)一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1、Cyclin D1 及β-actin），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后加入山羊抗鼠IgG 二抗，孵育2 h，洗滌3 次，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，蛋白相對(duì)表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白（β-actin）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞的作用濃度篩選 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞IL-6、IL-1β 水平均升高（均P＜0.05），而細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。與模型組相比，LPS+2、4、8 μmol/L 大黃酸組細(xì)胞IL-6、IL-1β 水平均降低（均P＜0.05），而細(xì)胞活力均升高（均P＜0.05）。因此本研究在模型組基礎(chǔ)上，選擇炎癥因子水平和細(xì)胞活力均有顯著差異且濃度較低的LPS+2 μmol/L 大黃酸作為大黃酸組，再分別加入NF-κB 信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082 和激活劑PMA進(jìn)行NF-κB 信號(hào)通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，見圖1、2。

圖1 各組細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β 水平比較

圖2 各組細(xì)胞活力比較

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。與模型組相比，大黃酸組和BAY 11-7082 組細(xì)胞增殖率均升高（均P＜0.05）。與大黃酸組相比，抑制劑組細(xì)胞增殖率進(jìn)一步升高（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），見圖3（插頁）。

圖3 各組細(xì)胞增殖率比較（A：各組細(xì)胞EdU 增殖圖，×200；B：各組細(xì)胞增殖率比較；與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與大黃酸組相比，cP＜0.05）

2.3 各組細(xì)胞遷移數(shù)比較 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞遷移數(shù)升高（P＜0.05）。與模型組相比，大黃酸組和BAY 11-7082 組細(xì)胞遷移數(shù)均降低（P＜0.05）。與大黃酸組相比，抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)進(jìn)一步降低（P＜0.05），激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)升高（P＜0.05），見圖4（插頁）。

圖4 各組細(xì)胞遷移數(shù)比較（A：各組細(xì)胞遷移圖，0.1%結(jié)晶紫染色，×200；B：各組細(xì)胞遷移數(shù)比較；與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與大黃酸組相比，cP＜0.05）

2.4 各組細(xì)胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。與模型組相比，大黃酸組和BAY 11-7082 組細(xì)胞Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），而Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）。與大黃酸組相比，抑制劑組細(xì)胞Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），激活劑組細(xì)胞Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而Caspase-1、p-NFκB p65 蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。各組細(xì)胞中NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平比較（A：各組細(xì)胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Cas‐pase-1 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)的電泳圖；B：各組細(xì)胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-1 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平比較；與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與大黃酸組相比，cP＜0.05）

3 討論

急性肺損傷會(huì)誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，加速炎癥細(xì)胞因子釋放及損傷肺上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞[13]。因此，對(duì)過度的炎癥反應(yīng)進(jìn)行阻遏可能會(huì)有效預(yù)防和治療急性肺損傷[14]。但目前對(duì)于急性肺損傷的治療仍缺乏低毒有效的手段。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥因其毒副反應(yīng)小、療效顯著等優(yōu)勢(shì)受到了越來越多的關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為熱毒、濕熱、痰熱和瘀血等發(fā)病因素的相互作用是引發(fā)急性肺損傷的主要因素，所以治療上通常以清熱解毒、祛痰化瘀等方法[15]。

大黃酸是一種天然的蒽醌衍生物，主要提取自大黃及虎杖等中草藥，具有較好的抗腫瘤、抗菌、抗炎及抗病毒活性[16]。眾多文獻(xiàn)表明，大黃及其提取物大黃酸對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。汪普求[17]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素與大黃酸聯(lián)合對(duì)百草枯中毒的大鼠肺損傷具有保護(hù)作用。蔣歡歡等[18]通過臨床試驗(yàn)證明鼻飼大黃輔助治療可有效降低急性肺損傷患者炎癥因子水平，促進(jìn)呼吸功能及血?dú)庵笜?biāo)恢復(fù)，縮短病情改善周期，防止病情進(jìn)展惡化。而LPS 是引起肺部炎癥導(dǎo)致急性肺損傷的重要原因之一[19]。因此，本研究通過LPS 誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞A549 建立體外模型，探討大黃酸對(duì)A549 細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組LPS 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞后，炎癥因子IL-6、IL-1β 水平均升高，且細(xì)胞活力降低。而在2、4、8 μmol/L 大黃酸處理LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞后，細(xì)胞活力明顯得到恢復(fù)，炎癥因子IL-6、IL-1β 水平顯著降低，說明大黃酸能夠促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞活力，抑制炎癥因子水平。本研究選擇有顯著差異且較低濃度的大黃酸（2 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞增殖率、Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平均降低，細(xì)胞遷移數(shù)、Caspase-1、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均升高，大黃酸組扭轉(zhuǎn)了LPS 對(duì)A549 細(xì)胞的作用。以上結(jié)果說明大黃酸可以減輕LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞炎癥損傷。

NF-κB 信號(hào)通路是與炎癥相關(guān)的經(jīng)典通路之一，近年來研究表明抑制NF-κB 信號(hào)通路能夠降低急性肺損傷的炎癥水平，發(fā)揮抗炎作用[20]。研究證明抑制NF-κB 信號(hào)通路可減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷，并對(duì)其發(fā)揮保護(hù)作用[21]。王瑞哲等[22]研究認(rèn)為當(dāng)下調(diào)炎癥信號(hào)通路NF-κB 時(shí)，可減少促炎因子TNF-α、IL-6 釋放，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，產(chǎn)生抗炎免疫環(huán)境，從而達(dá)到治療急性肺損傷的目的。但是關(guān)于大黃酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞中NF-κB 通路的調(diào)控作用未見報(bào)道，因此本研究以此為切入點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，LPS 處理A549 細(xì)胞后，p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高。經(jīng)大黃酸和BAY 11-7082 分別再次處理后，p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均降低，表明大黃酸和NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 可能抑制了NF-κB 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而后在大黃酸的基礎(chǔ)上分別加入NF-κB 信號(hào)通路抑制劑和激活劑進(jìn)行通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BAY 11-7082 增強(qiáng)了大黃酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖率和Cy‐clin D1 蛋白表達(dá)水平的促進(jìn)作用及細(xì)胞遷移數(shù)、Cas‐pase-1、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平的抑制作用，PMA則削弱大黃酸對(duì)細(xì)胞的這種作用，這些結(jié)果說明大黃酸可能是通過抑制NF-κB 信號(hào)通路的活化而保護(hù)LPS 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移的。

綜上所述，大黃酸對(duì)A549 細(xì)胞炎癥損傷具有保護(hù)作用，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞遷移，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。但大黃酸是否通過其他機(jī)制減輕對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷尚不明確，后續(xù)將進(jìn)一步深入探究，以期為大黃酸應(yīng)用于急性肺損傷的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。