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        刺槐素調(diào)控NF-κB/NFATc1信號(hào)軸抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究

        2023-07-06 03:14:58陳真顧娉郡何安妮雷新環(huán)郭宇華章禮煒
        浙江醫(yī)學(xué) 2023年12期
        關(guān)鍵詞:素處理刺槐貨號(hào)

        陳真 顧娉郡 何安妮 雷新環(huán) 郭宇華 章禮煒

        機(jī)體骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)有賴于成骨細(xì)胞的骨形成作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用之間的動(dòng)態(tài)平衡。若出現(xiàn)成骨細(xì)胞數(shù)目下降、成骨能力減弱,或破骨細(xì)胞數(shù)目增多、破骨能力增強(qiáng),可導(dǎo)致機(jī)體骨密度和骨質(zhì)量下降、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加等,最終引發(fā)骨質(zhì)疏松癥或繼發(fā)性骨破壞的發(fā)生[1]。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果,預(yù)計(jì)我國(guó)2050 年主要骨質(zhì)疏松性骨折(腕部、椎體和髖部)約達(dá)599 萬(wàn)例次,單單由此產(chǎn)生的醫(yī)療費(fèi)用將高達(dá)1 630 億元[2]。雙膦酸鹽(如唑來(lái)膦酸、阿侖膦酸鈉)可靶向抑制骨吸收,甲狀旁腺激素類似物(如特立帕肽)可促進(jìn)骨形成,雌激素替代療法可抑制破骨細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的骨吸收和降低骨重塑率,均被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥防治領(lǐng)域,但這些藥物往往伴隨著諸如一過(guò)性發(fā)熱、胃腸道不適、心血管風(fēng)險(xiǎn)等不良反應(yīng)[3]。目前,針對(duì)骨質(zhì)疏松癥防治的研究已成為國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)之一。刺槐素是一種提取自豇豆等植物的天然黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用[4],但在骨代謝中的作用尚缺乏相關(guān)報(bào)道。既往研究顯示,NF-κB 受體活化因子配體(recep‐tor activator of NF-κB ligand,RANKL)刺激下NF-κB/活化T-細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)信號(hào)軸的激活,在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。與此同時(shí),刺槐素可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制NF-κB 信號(hào)通路的作用,而該通路是RANKL 結(jié)合NF-κB 受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)受體后重要的下游信號(hào)通路之一[6]。本研究旨在探討刺槐素對(duì)破骨細(xì)胞分化過(guò)程的影響,并明確其作用機(jī)制是否與NF-κB/NFATc1 信號(hào)軸有關(guān)。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠20 只,購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0004],飼養(yǎng)于浙江省臺(tái)州醫(yī)院公共科研平臺(tái)SPF 動(dòng)物房[使用許可證號(hào):SYXK(浙)2019-0030]。小鼠在室溫20~25 ℃,濕度40%~60%,24 h 自然光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng),不限制飲水及進(jìn)食。本研究相關(guān)動(dòng)物飼養(yǎng)及操作已獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)(批準(zhǔn)文號(hào):tzyy-2019033)。

        1.2 試劑和儀器 刺槐素(貨號(hào):HY-N1346)購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress 公司,高速離心后使用二甲基亞砜(貨號(hào):ST038,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)溶解制成100 mmol/L 母液,分裝后置于-80 ℃冰箱保存。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)(貨號(hào):315-02)購(gòu)于美國(guó)Peprotech 公司;RANKL(貨號(hào):P00226)、總RNA 提取試劑(貨號(hào):R1100)均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;α-改良型MEM 完全培養(yǎng)基(貨號(hào):SH30265.01)購(gòu)于美國(guó)Hy‐clone 公司;澳洲特級(jí)FBS(貨號(hào):10099-141)購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell count kit 8,CCK-8)試劑盒(貨號(hào):K1018)購(gòu)于美國(guó)APExBIO 公司;cDNA 第一鏈合成試劑盒(貨號(hào):R123-01)、SYBR Green 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒(貨號(hào):Q121-02)均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;PBS(貨號(hào):C0221)、胰酶細(xì)胞消化液(貨號(hào):C0201)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(貨號(hào):C0222)、DAPI 染色液(貨號(hào):C1005)、非離子性去垢劑Triton X-100(貨號(hào):ST795)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(貨號(hào):ST2249)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):P0010)、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào):P0018)、Tris 緩沖+聚山梨酯-20 洗滌液(TBSTw)(貨號(hào):ST671)均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(tar‐trate resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒(貨號(hào):BZ-OC02)購(gòu)于蘇州必中生物科技有限公司;鬼筆環(huán)肽(FITC 標(biāo)記,貨號(hào):MF8203)購(gòu)于上海維琨生物科技有限公司;p65 抗體(貨號(hào):8242,兔抗)、Ser536位點(diǎn)磷酸化p65(phosphorylation-p65Ser536,p-p65Ser536)抗體(貨號(hào):3033,兔抗)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceralde‐hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(貨號(hào):5174,兔抗)均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體(貨號(hào):GB23303)購(gòu)于湖北武漢賽維爾生物科技有限公司;NFATc1(貨號(hào):ab25916,兔抗)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopro‐teinase-9,MMP-9)(貨號(hào):ab228402,兔抗)抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。Multiskan SkyHigh 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司;ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems 公司;DM IL LED倒置實(shí)驗(yàn)室顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica 公司;ChemiDoc Touch 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司。

        1.3 方法

        1.3.1 小鼠骨髓來(lái)源單核巨噬細(xì)胞(bone marrow-de‐rived monocyte/macrophage,BMMs)提取與培養(yǎng) 將小鼠麻醉后脫頸處死,分離小鼠雙下肢踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié),取出脛骨、股骨放置于裝有PBS 的細(xì)菌皿中,剔凈骨表面殘留物,并漂洗,隨后剪去股骨近端、脛骨遠(yuǎn)端小部分骨組織以暴露骨髓腔。使用1 ml 針筒抽取PBS 反復(fù)沖洗骨髓腔,將得到的骨髓使用α-改良型MEM 完全培養(yǎng)基重懸后1 500 r/min 離心4 min,倒掉上清液后使用含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基重懸,接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,過(guò)夜。第2 天去除細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,并用無(wú)菌PBS 沖洗3 次,加入適量含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基,將仍貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d,可見(jiàn)細(xì)胞呈短梭形,密度80%~90%。隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS 沖洗3 次,胰酶消化,計(jì)數(shù)后備用,即為BMMs。后續(xù)BMMs 培養(yǎng)均使用含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基,進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo)時(shí)采用含50 ng/ml RANKL、30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基。

        1.3.2 BMMs增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8法。將BMMs按0.4×104細(xì)胞/孔的密度種于96 孔板,設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組和9 個(gè)濃度(0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L)刺槐素處理組,共10 組,每組3 個(gè)重復(fù)孔。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后,將孔內(nèi)液體更換為對(duì)應(yīng)組別包含不同濃度刺槐素的完全培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng),隔天換液1 次。分別培養(yǎng)48、72、96 h 后,向每孔中加入10 μl CCK-8試劑,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度(optical density,OD)值。

        1.3.3 BMMs 破骨分化誘導(dǎo) 將BMMs 分別按10×104、40×104細(xì)胞/孔的密度種于24、6 孔板內(nèi)。過(guò)夜貼壁后,使用破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+50 ng/ml RANKL +30 ng/ml M-CSF)進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo),隔天換液。在破骨分化誘導(dǎo)過(guò)程中,第4 天可在顯微鏡下觀察到BMMs 開始匯聚、融合,出現(xiàn)3 個(gè)細(xì)胞核以上的細(xì)胞,第6 天觀察到邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細(xì)胞。

        1.3.4 BMMs 破骨分化能力檢測(cè) 采用TRAP 染色。TRAP 作為破骨細(xì)胞特征性標(biāo)志酶,分布于細(xì)胞質(zhì)中,可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)。經(jīng)過(guò)6 d 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,對(duì)照組中可出現(xiàn)大量邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細(xì)胞。此時(shí),吸去24 孔板中各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基,PBS 沖洗1 遍后加入500 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,隨后PBS 沖洗2 遍,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TRAP 染色。隨后使用倒置顯微鏡觀察并拍照,TRAP 陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目≥3 個(gè)的細(xì)胞計(jì)為破骨細(xì)胞,并通過(guò)Image J 軟件進(jìn)行破骨細(xì)胞相對(duì)大小的計(jì)算,破骨細(xì)胞相對(duì)大小=各組破骨細(xì)胞大小/溶劑對(duì)照組中破骨細(xì)胞大小的平均值。

        1.3.5 破骨細(xì)胞特征結(jié)構(gòu)偽足小體檢測(cè) 采用破骨細(xì)胞偽足小體免疫熒光染色。偽足小體是構(gòu)成成熟破骨細(xì)胞在非礦化界面上所形成的封閉帶狀結(jié)構(gòu)的重要組成部分,發(fā)揮著黏附、力學(xué)感知等功能。經(jīng)過(guò)6 d破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,可在成熟破骨細(xì)胞周圍觀察到較為立體、邊界清晰的封閉帶狀結(jié)構(gòu),吸去24 孔板中各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基,PBS 沖洗1 遍后加入300 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,隨后PBS 沖洗2 遍。在染色階段,首先向每孔加入300 μl 含0.1% Triton X-100的PBS 溶液,室溫孵育3 min 進(jìn)行胞膜通透,PBS 沖洗2 遍后加入300 μl 含1% BSA 的PBS 溶液進(jìn)行封閉20 min。隨后PBS 沖洗2 遍后加入200 μl 含1%鬼筆環(huán)肽的PBS 溶液避光孵育20 min 后,再次使用PBS 沖洗2 遍。最后加入200 μl DAPI 染色液避光孵育3 min后,使用PBS 沖洗2 遍并置于倒置熒光顯微鏡中拍照。此外,在評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞活性的指標(biāo)中,單個(gè)偽足小體所圍成的封閉帶(即單個(gè)破骨細(xì)胞)內(nèi)所含細(xì)胞核數(shù)目與破骨細(xì)胞的大小、活性密切相關(guān)?;诟鹘M免疫熒光染色結(jié)果,計(jì)算統(tǒng)計(jì)單個(gè)破骨細(xì)胞內(nèi)所含細(xì)胞核數(shù)目,以反映破骨細(xì)胞成熟度。

        1.3.6 BMMs 破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1及相關(guān)特征基因耐酒石酸酸性磷酸酶(acid phospha‐tase 5,tartrate resistant,ACP5)、破骨細(xì)胞相關(guān)受體(os‐teoclast associated receptor,OSCAR)、組織蛋白酶K(ca‐thepsin K,CTSK)、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。將BMMs 按40×104細(xì)胞/孔的密度種于6 孔板,過(guò)夜貼壁后,將培養(yǎng)基更換為含有對(duì)應(yīng)組別藥物的破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基,進(jìn)行破骨誘導(dǎo),隔天換液。6 d 后吸去各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基,預(yù)冷的PBS沖洗1 次后每孔加入500 μl 總RNA 提取試劑,置于冰上按說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。RNA 樣品使用RNA/DNA 紫外可見(jiàn)光度法定量測(cè)定濃度后,使用cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(1 μg RNA,使用20 μl 反轉(zhuǎn)錄體系,反應(yīng)結(jié)束后使用雙蒸水稀釋至100 μl 備用)。后續(xù)qPCR 所用引物序列如下:NFATc1上游:5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3',下游:5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3';ACP5 上游:5'-TGT‐GGCCATCTTTATGCT- 3',下游:5'- GTCATTTCTTT‐GGGGCTT-3';OSCAR 上游:5'-CTGCTGGTAACGGAT‐CAGCTCCCCAGA-3',下游:5'-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3';CTSK 上游:5'-ACGGAGGCATT‐GACTCTGAAGATG-3',下游:5'-GGAAGCACCAAC‐GAGAGGAGAAAT-3';MMP-9 上游:5'-GTCCAGAC‐CAAGGGTACAGC-3',下游:5'-ATACAGCGGGTACAT‐GAGCG-3';18S 核糖體RNA 上游:5'-CGGCTACCA‐CATCCAAGGAA-3',下游:5'-GCTGGAATTACCGCG‐GCT-3'。所使用的qPCR反應(yīng)體系為20 μl(SYBR Green 10 μl,cDNA 2 μl,前后鏈引物mix 0.5 μl,ddH2O 7.5 μl),反應(yīng)條件為95 ℃5 min 預(yù)變性,隨后95 ℃10 s 變性,65 ℃30 s 擴(kuò)增共循環(huán)40 次。分析結(jié)果時(shí),以18S核糖體RNA為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.3.7 BMMs 破骨分化過(guò)程中NFATc1、MMP-9、pp65Ser536、p65 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。為了進(jìn)一步明確刺槐素抑制BMMs 破骨分化的作用及機(jī)制,本研究收集BMMs 破骨誘導(dǎo)分化第0、4、6 天時(shí)對(duì)照組、2 μmol/L 刺槐素處理組的蛋白樣本,用于檢測(cè)NFATc1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平。與此同時(shí),本研究也收集了對(duì)照組及2 μmol/L 刺槐素處理組(預(yù)處理2 h)BMMs 在RANKL 刺激下第0、5、15、30、60 分鐘時(shí)的蛋白樣本,用于檢測(cè)p-p65Ser536、p65 的表達(dá)水平,以評(píng)估刺槐素對(duì)RANKL 刺激下NF-κB 信號(hào)通路活性的影響。所收集的各組細(xì)胞吸棄培養(yǎng)液后使用PBS清洗1次,分別加入150 μl 蛋白裂解液后在冰上靜置10 min。隨后將蛋白裂解液以12 000 r/min 離心15 min,取上清液并測(cè)定總蛋白濃度。將所配得的蛋白體系通過(guò)10%分離膠跑開后,在300 mA 恒定電流下轉(zhuǎn)膜90 min,用5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入一抗MMP-9(1∶1 000)、NFATc1(1∶1 000)、p-p65Ser536(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。第2 天取出孵育盒后使用TBSTw 洗滌3 次,10 min/次,在相應(yīng)的二抗中孵育2 h,再次用TBSTw 洗3 次,曝光、顯影,得到對(duì)應(yīng)條帶,并使用Image J 軟件評(píng)估各個(gè)泳道的灰度值進(jìn)行分析。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=各組灰度值/第1 泳道對(duì)照組平均灰度值。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 刺槐素對(duì)BMMs 增殖活性的影響 在使用不同濃度刺槐素處理BMMs 細(xì)胞48 h 后,10 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對(duì)照組的0.80±0.03 降低至0.62±0.04(P<0.01);72 h 后,5 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對(duì)照組的1.39±0.05 降低至1.16±0.05(P<0.01);96 h 后,5 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對(duì)照組的1.81±0.05 降低至1.38±0.05(P<0.01),見(jiàn)圖1。CCK-8 實(shí)驗(yàn)提示5 μmol/L 及以上濃度的刺槐素可顯著抑制BMMs 增殖活性,而2 μmol/L 及以下濃度的刺槐素對(duì)BMMs 無(wú)明顯毒性。

        圖1 刺槐素對(duì)BMMs 增殖活性的影響(A:不同濃度刺槐素處理48 h 后對(duì)BMMs 增殖活性的影響;B:不同濃度刺槐素處理72 h 后對(duì)BMMs 增殖活性的影響;C:不同濃度刺槐素處理96 h 后對(duì)BMMs 增殖活性的影響)

        2.2 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化的影響 通過(guò)檢測(cè)刺槐素對(duì)BMMs 增殖活性的影響,發(fā)現(xiàn)2 μmol/L 及以下濃度的刺槐素對(duì)BMMs 增殖無(wú)明顯抑制作用,隨后進(jìn)一步探究了刺槐素在無(wú)細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)對(duì)BMMs 破骨分化的影響。在1、2 μmol/L 刺槐素處理下,BMMs 破骨分化受到了明顯的抑制,見(jiàn)圖2A(插頁(yè))。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示,與對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)目(186.67±7.51)個(gè)/孔比較,1 μmol/L 刺槐素處理組減少至(105.67±8.62)個(gè)/孔,而2 μmol/L 刺槐素處理組中僅有(28.67±4.51)個(gè)/孔,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見(jiàn)圖2B(插頁(yè))。為進(jìn)一步明確刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了破骨細(xì)胞相對(duì)大小,與對(duì)照組的1.00±0.11 比較,1 μmol/L 刺槐素處理組破骨細(xì)胞相對(duì)大小減少至0.27±0.04,而2 μmol/L 刺槐素處理組中僅為0.05±0.01,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見(jiàn)圖2C(插頁(yè))。

        圖2 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化的影響(A:刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化影響的TRAP 染色圖,×50;B:刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中破骨細(xì)胞數(shù)目的影響,與對(duì)照組比較,aP<0.01;C:刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中破骨細(xì)胞相對(duì)大小的影響,與對(duì)照組比較,aP<0.01)

        2.3 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中偽足小體形成的影響 破骨細(xì)胞偽足小體免疫熒光染色提示在1 μmol/L 刺槐素處理下,偽足小體所圍成的封閉帶(即破骨細(xì)胞)數(shù)目較對(duì)照組明顯減少,而在2 μmol/L 刺槐素處理組中僅有少量封閉帶形成,見(jiàn)圖3A(插頁(yè))。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示,與對(duì)照組的(50.29±8.56)個(gè)比較,1 μmol/L 刺槐素處理組單個(gè)破骨細(xì)胞內(nèi)所含細(xì)胞核數(shù)目降低至(10.86±2.41)個(gè),而在2 μmol/L 刺槐素處理組中僅為(3.43±0.79)個(gè),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見(jiàn)圖3B(插頁(yè))。

        圖3 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中偽足小體生成的影響(A:刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中偽足小體生成影響的破骨細(xì)胞偽足小體免疫熒光染色圖,×100;B:刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中單個(gè)破骨細(xì)胞內(nèi)所含細(xì)胞核數(shù)目的影響,與對(duì)照組比較,aP<0.01)

        2.4 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA 表達(dá)水平的影響 在刺槐素處理后,與對(duì)照組比較,1 μmol/L 刺槐素處理組、2 μmol/L刺槐素處理組破骨分化核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 和ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平均下調(diào)(均P<0.01),見(jiàn)圖4。

        圖4 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA 表達(dá)水平的影響

        2.5 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1、特征蛋白MMP-9 表達(dá)和NF-κB 信號(hào)通路活性的影響 隨著RANKL 處理時(shí)間的增加,對(duì)照組中NFATc1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平逐漸升高,第6 天時(shí)表達(dá)水平最高。而在2 μmol/L 刺槐素處理下,第4、6 天時(shí)2 μmol/L 刺槐素處理組中NFATc1、MMP-9 表達(dá)水平均較對(duì)照組降低,結(jié)合前述qRT-PCR 結(jié)果,進(jìn)一步提示刺槐素可通過(guò)降低RANKL 刺激下BMMs 細(xì)胞內(nèi)NFATc1、MMP-9 的表達(dá),抑制其破骨分化過(guò)程,見(jiàn)圖5。隨后本研究進(jìn)一步檢測(cè)刺槐素是否可以影響RANKL 刺激下NF-κB 信號(hào)通路中p65Ser536磷酸化過(guò)程。RANKL 刺激下可顯著引起對(duì)照組中BMMs 內(nèi)p65Ser536位點(diǎn)的磷酸化,以第5、15 分鐘最為明顯。而在使用2 μmol/L 刺槐素預(yù)處理2 h 后,BMMs 內(nèi)p65Ser536位點(diǎn)在RANKL 刺激下的磷酸化水平較同時(shí)間對(duì)照組出現(xiàn)顯著抑制,見(jiàn)圖6。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,刺槐素可通過(guò)下調(diào)RANKL 刺激下NF-κB 信號(hào)通路活性及其下游核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 的表達(dá),從而抑制BMMs 破骨分化過(guò)程。

        圖5 刺槐素對(duì)BMMs 破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1、特征蛋白MMP-9 表達(dá)的影響(A:對(duì)照組及2 μmol/L 刺槐素處理組BMMs 進(jìn)行破骨誘導(dǎo)第0、4、6 天后NFATc1、MMP-9 蛋白表達(dá)的電泳圖;B:對(duì)照組及2 μmol/L 刺槐素處理組BMMs 進(jìn)行破骨誘導(dǎo)第0、4、6 天后NFATc1、MMP-9 蛋白表達(dá)水平比較,與對(duì)照組比較,a P<0.05,b P<0.01)

        圖6 刺槐素對(duì)BMMs 在RANKL 刺激下NF-κB 信號(hào)通路活性的影響(A:對(duì)照組及2 μmol/L 刺槐素預(yù)處理組BMMs 在RANKL 刺激第0、5、15、30、60 分鐘后p65Ser536位點(diǎn)磷酸化及總p65 表達(dá)的電泳圖;B:對(duì)照組及2 μmol/L 刺槐素預(yù)處理組BMMs 在RANKL 刺激第0、5、15、30、60 分鐘后p65Ser536位點(diǎn)磷酸化表達(dá)水平比較,與對(duì)照組比較,a P<0.01)

        3 討論

        破骨細(xì)胞作為體內(nèi)一種高度分化的終末細(xì)胞,是體內(nèi)唯一可以進(jìn)行骨吸收的細(xì)胞,以TRAP 陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目≥3 個(gè)為顯著特征。當(dāng)配體RANKL 與細(xì)胞表明的受體RANK 結(jié)合后,可觸發(fā)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6,引發(fā)下游絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(p38、JNK、ERK)、NF-κB 等信號(hào)通路的激活。在NFκB 信號(hào)通路中,NF-κB 抑制物激酶(IκB kinase,IKKs)被激活,活化的IKKs(IKKα 和IKKβ)可使NF-κB 特異性抑制因子IκB 特定部位的絲氨酸磷酸化,激活NFκB(p50 和p65 特定位點(diǎn)磷酸化)?;罨腘F-κB 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),p50 和p65 引起原癌基因蛋白(c-fos)、NFATc1 表達(dá)增加,c-fos 與NFATc1 相互作用,引起更下游破骨細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。正常情況下,NF-κB以p65-p50 異二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,兩個(gè)亞基于N 端共享一個(gè)同源區(qū),以確保其二聚化并與DNA結(jié)合,同源區(qū)內(nèi)同時(shí)也包含核定位信號(hào)(nuclear local‐ization signal,NLS)[4-6]。在經(jīng)典的NF-κB 信號(hào)通路中,NF-κB 在靜息狀態(tài)下與細(xì)胞質(zhì)中IκBα 結(jié)合而處于非活化狀態(tài),同源區(qū)的NLS 也被IκBα 所掩蓋。當(dāng)細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激后,胞質(zhì)中異三聚體IκB 激酶(IKK1、IKK2、IKKγ)激活并磷酸化IκBα N 端2 個(gè)絲氨酸殘基,隨后E3 泛素連接酶識(shí)別該殘基并使IκBα 發(fā)生多聚泛素化,進(jìn)而被泛素依賴性蛋白酶體降解。伴隨著IκBα 的降解,NF-κB 暴露出NLS 后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。

        既往文獻(xiàn)報(bào)道刺槐素具有抗炎、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)胃腸道黏膜及抗誘變等多種作用[4]。在體內(nèi)外抗腫瘤作用方面,刺槐素可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫與端粒位置效應(yīng)、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[9]。Janeesh等[10]研究發(fā)現(xiàn)刺槐素在mRNA 水平抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)2 和TLR4 表達(dá),并通過(guò)調(diào)節(jié)TLR-NF-κB 信號(hào)通路抑制NF-κB p65 的易位,從而抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生并下調(diào)炎癥酶如環(huán)氧合酶、脂氧合酶、一氧化氮合酶和前列腺素E2。錢艷等[11]研究表明刺槐素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活化減少TNF-α 誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)、分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1。刺槐素具有多種較為有效的藥理作用,但其在骨代謝相關(guān)領(lǐng)域的功能國(guó)內(nèi)外尚未研究。本研究利用TRAP 染色發(fā)現(xiàn)刺槐素可在無(wú)明顯細(xì)胞毒性的濃度區(qū)間內(nèi)(1 及2 μmol/L)濃度依賴性地抑制BMMs 在RANKL 誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞分化。在BMMs 破骨分化過(guò)程中,偽足小體的形成及結(jié)構(gòu)完整性直接影響著破骨細(xì)胞的分化及其骨吸收活性,且偽足小體主要由肌動(dòng)蛋白組成,可被鬼筆環(huán)肽特異性結(jié)合而在熒光顯微鏡中顯影。在TRAP 染色的基礎(chǔ)之上,本研究進(jìn)一步利用破骨細(xì)胞偽足小體免疫熒光染色明確了刺槐素對(duì)偽足小體形成過(guò)程中的抑制作用,并顯著降低單個(gè)破骨細(xì)胞內(nèi)所含細(xì)胞核數(shù)目,減少了破骨細(xì)胞分化的成熟度。最后,利用Western blot 法發(fā)現(xiàn)在刺槐素處理下,NF-κB 信號(hào)通路中p65 蛋白在Ser536 位點(diǎn)的磷酸化水平得到顯著的抑制,進(jìn)而下調(diào)了下游核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 和特征蛋白MMP-9 的表達(dá),進(jìn)一步明確了其抑制破骨分化的機(jī)制。

        本研究結(jié)果表明,刺槐素可在無(wú)明顯細(xì)胞毒性的濃度區(qū)間內(nèi),通過(guò)抑制RANKL 刺激NF-κB 通路的活化,下調(diào)核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 的表達(dá),顯著抑制BMMs 破骨分化誘導(dǎo)過(guò)程及相關(guān)特征基因表達(dá)。刺槐素可起到防治破骨細(xì)胞分化過(guò)度或功能活躍所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞等骨量丟失疾病,但尚需更進(jìn)一步的機(jī)制研究及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證。

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