王 釤，張悅怡，劉田園，盧美希，戴 璇，劉亞鴿，張艷菲，王麗麗，張東偉[]

? 藥理與臨床?

四妙散改善高尿酸血癥和腎損傷以及調(diào)節(jié)腎臟線粒體相關(guān)蛋白的作用研究

王 釤1，張悅怡1，劉田園1，盧美希1，戴 璇1，劉亞鴿1，張艷菲2，王麗麗3*，張東偉1*[1]

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院糖尿病研究中心，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，北京 102488 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 102488

探索四妙散改善高尿酸血癥小鼠尿酸代謝和腎損傷的作用和可能的作用機制。采用氧嗪酸鉀（300 mg/kg）聯(lián)合次黃嘌呤（500 mg/kg）建立急性高尿酸血癥小鼠模型，然后給予四妙散水提液（4.55、9.1、18.2 g/kg）干預(yù)7 d。利用生化法分別測定血清和尿液中尿酸（uric acid，UA）的含量，血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和腎臟中還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量，以及肝臟中黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的活力。利用Western blotting法檢測腎臟線粒體融合和分裂相關(guān)蛋白表達。蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎臟的病理變化。四妙散顯著降低高尿酸血癥小鼠血清中UA含量（＜0.05、0.01），顯著升高尿液中UA含量（＜0.05、0.001），顯著升高血清SOD活力和腎臟中GSH水平（＜0.05、0.01、0.001），顯著降低血清GSSG和MDA水平（＜0.05、0.001），顯著降低肝臟中XOD活性（＜0.05）。同時，四妙散可顯著升高腎臟線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）、MFN2、視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助活化因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）蛋白水平（＜0.05），降低線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein1，DRP1）蛋白表達水平（＜0.05），進而抑制其腎臟的病理改變。四妙散能通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達，增強機體抗氧化應(yīng)激的能力，進而改善尿酸代謝和抑制腎損傷。

四妙散；高尿酸血癥；腎損傷；氧化應(yīng)激；線粒體

尿酸是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物，在體內(nèi)過度積累會導(dǎo)致高尿酸血癥。而尿酸鹽晶體在關(guān)節(jié)、腎臟等組織中過度沉積能誘發(fā)痛風(fēng)[1]和慢性腎臟疾病[2]等。流行病學(xué)研究顯示飲酒、吸煙、肥胖、糖尿病、高血壓和血脂異常等是誘發(fā)高尿酸血癥的主要危險因素[3-4]。據(jù)統(tǒng)計，2018—2019年中國成年人的高尿酸血癥患病率為14.0%，相比2015—2016年患病率顯著升高。目前臨床常用的降血尿酸藥物，包括黃嘌呤氧化酶抑制劑、促尿酸排泄藥物和重組尿酸酶制劑等，都存在著一定的局限性，如別嘌醇可能誘發(fā)超敏反應(yīng)，非布司他具有潛在的心血管風(fēng)險，苯溴馬隆具有損傷肝功能、酸化尿液、減少尿酸代謝和排泄的不良反應(yīng)[5]，這促使研究者進一步研發(fā)高效低毒的抗高尿酸藥物。

高尿酸血癥的主要病因是嘌呤代謝紊亂而引起的尿酸產(chǎn)生過多或排泄失衡。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中的黃嘌呤氧化還原酶（xanthine oxidoreductase，XOR）是參與嘌呤分解代謝的關(guān)鍵酶，XOR由黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，XDH）和黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）組成，后者在尿酸的生成過程發(fā)揮著重要作用[6-7]。此外，XOD還可通過產(chǎn)生超氧化物和過氧化氫促進體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生。另有研究表明，尿酸一旦進入細胞，就會成為一種促氧化劑，增加ROS的過度生成[8-9]。

線粒體與機體的氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。受損的線粒體能導(dǎo)致機體ROS的過度積累[10-11]。反過來，ROS蓄積也可能導(dǎo)致線粒體功能損傷[12]。研究表明，線粒體融合與分裂活動由眾多線粒體功能蛋白參與完成，其動態(tài)平衡是線粒體維持有效功能的關(guān)鍵[13]。過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助活化因子-1（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1）家族參與線粒體形成和能量代謝，且在調(diào)控其他細胞功能方面也發(fā)揮著核心作用[14]。PGC-1α在氧化應(yīng)激中促進抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，并參與調(diào)控脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體生物發(fā)生和動力學(xué)等相關(guān)基因的表達[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥可導(dǎo)致大鼠腎臟線粒體功能障礙，其病理機制與腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激損傷相關(guān)[16]。

四妙散首載于清代醫(yī)家張秉承所著的《成方便讀》，由黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁4味中藥組成，以黃柏為君藥，其主要功效為清熱祛濕，臨床常應(yīng)用于濕熱下注所致筋骨疼痛、下肢痿軟無力、足膝紅腫疼痛等癥。研究表明，四妙散具有治療痛風(fēng)和腎病綜合征等的功效[17]，這種作用可能與調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性有關(guān)[18]。但是，四妙散能否通過調(diào)節(jié)腎臟組織線粒體的生物活性，增強機體抵抗氧化應(yīng)激的能力，進而改善血尿酸的代謝和腎功能，尚未見相關(guān)報道。因此，本研究以氧嗪酸鉀和次黃嘌呤聯(lián)合誘發(fā)的高尿酸血癥小鼠為模型，探討四妙散降低血尿酸的作用以及對腎臟線粒體相關(guān)蛋白的影響，以期為防治高尿酸血癥及其并發(fā)癥的藥物研究提供新的策略。

1 材料

1.1 動物

48只SPF級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均以正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實驗方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2021042303-2017）。

1.2 藥材

四妙散由黃柏、蒼術(shù)、牛膝和薏苡仁組成，以上藥材購自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮、菊科植物北蒼術(shù)(DC.) Koidz.的干燥根莖、莧科植物牛膝Bl.的干燥根、禾本科植物薏苡-jobi L. var.(Roman.) Stapf的干燥成熟種仁。

1.3 藥品與試劑

對照品鹽酸小檗堿（批號633-65-8，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、β-蛻皮激素（批號5289-74-7，質(zhì)量分數(shù)＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；氧嗪酸鉀（批號P831461）、次黃嘌呤（批號HB11076）購自上海麥克林生化科技有限公司；別嘌醇（批號05200502）購自上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司；尿酸測試盒（批號C12-2-1）、XOD測試盒（批號A002-1-1）、微量還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測定試劑盒（批號A006-2-1）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）測試盒（批號A061-1-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號A003-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號A001-3-2）購自南京建成生物工程研究所；線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）抗體（批號66776-1-Ig）、MFN2抗體（批號12186-1-AP）、視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）抗體（批號27733-1-AP）、線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein1，DRP1）抗體（批號12957-1-AP）、PGC-1α抗體（批號66369-1-Ig）、β-actin抗體（批號66009-1-Ig）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號SA00001-2）、HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號SA00001-1）購自Proteintech公司。

1.4 儀器

BSA224S型電子天平（德國Sartorius公司）；FLUO star Omega多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）；22331 Hamburg離心機（德國Eppendorf公司）；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司）；5800Multi型全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）；HPLC/Q-TOF-MS分析儀（美國Waters公司）；BX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 四妙散水提液的制備及主要成分含量測定

將適量四妙散（黃柏15 g、蒼術(shù)15 g、牛膝10 g、薏苡仁30 g，總生藥量為70 g）先加入10倍體積的去離子水，煎煮2 h后倒出，再加入8倍體積的去離子水，煎煮2 h后倒出，合并水煎液，濾去藥渣，濃縮至所需的濃度。根據(jù)臨床成人生藥量和體表面積法，四妙散中劑量組小鼠給藥量為9.1 g/kg，低、高劑量組小鼠給藥量分別為4.55、18.2 g/kg。

四妙散水提液稀釋100倍得進樣樣品，對照品精準稱定并溶于甲醇，配得30 μg/mL鹽酸小檗堿和1 mg/mL β-蛻皮激素，然后將樣本和對照品通過0.22 mm膜濾過，再進行HPLC/Q-TOF-MS分析。色譜條件：Waters C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～50 min，95%～10% B；50～50.1 min，10%～95% B；50.1～55 min，95% B；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量10 μL。質(zhì)譜條件：正、負離子模式；質(zhì)量范圍/100～1500；離子源噴霧電壓3.5 kV；碰撞能量35 eV；毛細管溫度320 ℃；探頭加熱溫度400 ℃。結(jié)果用Thermo Xcalibur quality Browser進行分析。

2.2 高尿酸血癥小鼠分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成對照組、模型組、別嘌醇（5 mg/kg）組和四妙散低、中、高劑量（4.55、9.1、18.2 g/kg）組，每組8只。根據(jù)Zhang等[19]造模方法復(fù)制高尿酸小鼠模型，除對照組外，其余小鼠分別用氧嗪酸鉀（300 mg/kg，0.9%生理鹽水配制，ip）和次黃嘌呤（500 mg/kg，0.5%羧甲基纖維素鈉配制，ig）造模。對照組小鼠分別ig等體積0.5%羧甲基纖維素鈉和ip等體積生理鹽水，1次/d。每次造模1 h后ig給藥，對照組和模型組ig等體積去離子水，連續(xù)7 d。第6天給藥后，將小鼠放置代謝籠中收集尿液。第7天給藥1 h后分別取血、肝臟和腎臟，其中一部分肝臟和腎臟置于?80 ℃凍存，另一部分置于4%多聚甲醛固定。

2.3 血清生化指標測定

按照試劑盒說明書測定血清和尿液中尿酸含量，測定血清中GSH、GSSG、MDA含量及SOD活力，肝組織XOD活力以及腎組織GSH含量。

2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化

將固定在4%多聚甲醛溶液中的腎臟組織按照常規(guī)HE染色法進行脫水、包埋、切片和染色，中性樹膠封片后置于倒置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化并拍照。

2.5 Western blotting檢測腎組織MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白表達的影響

將適量的腎臟組織用RIPA裂解液裂解，然后采用低溫機械勻漿的方法提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將變性蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，分別加入MFN1（1∶4000）、MFN2（1∶4000）、OPA1（1∶2000）、DRP1（1∶1000）和PGC-1α（1∶4000）抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入二抗（1∶4000），室溫孵育1 h后，用ECL超敏發(fā)光液顯色，Azure凝膠成像儀拍照。以相應(yīng)的β-actin作為內(nèi)參，利用Image J圖像分析軟件對各目標條帶的灰度值進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 四妙散水提液的主要化學(xué)成分分析

利用UPLC/MS技術(shù)測定四妙散中的鹽酸小檗堿和β-蛻皮激素的含量。通過面積歸一化法[20]以對照品和樣品中鹽酸小檗堿與β-蛻皮激素的色譜圖（圖1）峰面積計算得，鹽酸小檗堿在四妙散中的質(zhì)量分數(shù)為7.6 mg/g，占黃柏生藥含量的3.54%；β-蛻皮激素在四妙散中的質(zhì)量分數(shù)為1.9 mg/g，占牛膝生藥含量的1.36%?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定[21]，小檗堿在黃柏中質(zhì)量分數(shù)不低于3%，β-蛻皮激素在牛膝中質(zhì)量分數(shù)不低于0.03%，本研究四妙散中鹽酸小檗堿與β-蛻皮激素的含量符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

3.2 四妙散對高尿酸血癥小鼠血清和尿液中尿酸含量的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中尿酸水平顯著升高（＜0.001），尿液中尿酸水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清中尿酸水平顯著降低（＜0.001），尿液中尿酸水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。由實驗結(jié)果可知，各劑量的四妙散均明顯減少血液中尿酸含量，促進尿酸隨尿液排出體外。然而，不同劑量的四妙散降低血清尿酸的效果無明顯差異，低、中劑量的四妙散促進尿酸隨尿液的排泄的作用明顯高于高劑量的四妙散（＜0.05）。以上結(jié)果提示，四妙散能降低高尿酸血癥小鼠血液中的尿酸水平，同時促進尿酸經(jīng)腎臟的排泄。

圖1 四妙散 (A)、β-蛻皮激素(B) 和鹽酸小檗堿(C) 的UPLC/MS色譜圖

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與四妙散高劑量組比較：▲P＜0.05，下圖同

3.3 四妙散對高尿酸血癥小鼠血清中GSH、GSSG、SOD、MDA含量的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中GSH水平和SOD活力顯著降低（＜0.05），GSSG和MDA水平顯著升高（＜0.05、0.001）；與模型組比較，各給藥組血清中GSH水平和SOD活力顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），GSSG和MDA水平顯著升降低（＜0.05、0.001）。以上結(jié)果表明，四妙散能夠促進高尿酸血癥小鼠的還原氧化平衡，從而改善小鼠機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖3 四妙散對高尿酸小鼠血清中GSH、GSSG、MDA水平和SOD活力的影響(, n = 6)

3.4 四妙散對高尿酸血癥小鼠肝臟XOD的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠肝勻漿中XOD活力顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組肝勻漿中XOD活力顯著降低（＜0.05）。表明四妙散干預(yù)能降低高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性，抑制尿酸的生成。

3.5 四妙散對高尿酸血癥小鼠腎臟組織病理變化的影響

如圖5所示，對照組小鼠的腎小球、間質(zhì)和腎小管形態(tài)正常，細胞排列緊密。模型組小鼠腎組織內(nèi)腎小球萎縮，腎小管擴張且擴張腔內(nèi)可見腎小管上皮脫落，管型，腎小管空泡化，結(jié)構(gòu)不清。與模型組比較，四妙散組小鼠腎組織損傷程度明顯緩解，腎小管擴張和腎小球萎縮明顯改善。以上結(jié)果表明四妙散對高尿酸誘發(fā)的腎臟損傷具有保護作用。

圖4 四妙散對高尿酸血癥小鼠肝勻漿中XOD活力的影響(, n = 6)

綠色箭頭表示腎小球萎縮，黃色箭頭表示腎小管擴張

3.6 四妙散對高尿酸血癥小鼠腎臟中GSH含量的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟中GSH水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組腎臟中GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01），這表明四妙散能提高高尿酸血癥小鼠腎組織的抗氧化能力。

圖6 四妙散對高尿酸血癥小鼠腎臟中GSH含量的影響(, n = 6)

3.7 四妙散對高尿酸血癥小鼠腎臟組織MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白表達的影響

由于四妙散低劑量在改善尿酸代謝方面，與中、高劑量具有類似或者較好的效果，所以本實驗僅研究四妙散低劑量改善腎損傷的可能作用機制。既往研究提示，MFN1、MFN2調(diào)控線粒體外膜的融合，OPA1調(diào)控線粒體內(nèi)膜的融合，DRP1調(diào)控線粒體的分裂，PGC-1α調(diào)控線粒體的能量代謝、參與線粒體結(jié)構(gòu)形成[22-23]。如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05），DRP1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，四妙散低劑量組腎臟中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白表達水平明顯升高（＜0.05），DRP1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。這表明四妙散可顯著改善高尿酸血癥小鼠腎臟的線粒體功能。

圖7 四妙散對高尿酸血癥小鼠腎臟組織中線粒體融合和分裂相關(guān)蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

本研究采用氧嗪酸鉀和次黃嘌呤聯(lián)合給藥法建立急性高尿酸血癥小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平顯著升高，尿液尿酸水平顯著降低，肝臟XOD活性增強，血清GSH水平及SOD活力顯著降低，GSSG、MDA水平顯著升高；腎臟組織出現(xiàn)腎小管擴張、上皮脫落及腎小球萎縮等一系列病理變化，腎臟GSH含量顯著降低，且線粒體MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白表達均顯著降低，DRP1蛋白表達顯著升高。而四妙散水提液能通過逆轉(zhuǎn)上述指標的變化，改善高尿酸血癥小鼠的尿酸代謝和腎組織損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平較空白組顯著升高，而四妙散干預(yù)后能明顯降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，這一結(jié)果與文獻報道一致[24]。既往研究表明，機體內(nèi)XOD可將次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，并在將后者氧化為尿酸的過程中產(chǎn)生2個超氧自由基，而細胞外的超氧化物能夠歧化為過氧化氫，細胞外超氧自由基和過氧化氫分別通過氯通道3和水通道穿透細胞膜，隨后啟動細胞內(nèi)信號和氧化應(yīng)激[25-26]。谷胱甘肽是細胞重要的抗氧化緩沖劑，主要以GSH和GSSG的形式存在，谷胱甘肽氧化與還原酶催化二者的互相轉(zhuǎn)化，以維持細胞內(nèi)谷胱甘肽的穩(wěn)態(tài)和氧化還原平衡[27]。SOD和MDA也是檢測氧化應(yīng)激的標志物，前者清除對機體有害的超氧陰離子自由基，后者為自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。本實驗結(jié)果顯示，四妙散能夠升高高尿酸血癥小鼠血清或腎組織中GSH水平及SOD活力，降低GSSG和MDA水平，這說明四妙散改善高尿酸血癥小鼠體內(nèi)尿酸代謝的作用可能與促進氧化還原平衡有關(guān)。此外，低、中、高劑量的四妙散降血尿酸、抗氧化及抑制尿酸形成作用無明顯差異，低、中劑量的四妙散促尿酸排泄作用明顯優(yōu)于高劑量，緩解肝損傷作用與劑量呈相反趨勢。

本研究和其他實驗室研究均表明[28]，四妙散能促進尿酸的排泄，從而改善尿酸代謝，且具有腎保護作用。腎臟線粒體動力學(xué)與其功能有著密切聯(lián)系，線粒體動力學(xué)是指活細胞中的線粒體持續(xù)不斷地相互融合連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)或分裂形成彼此分散存在的個體動態(tài)變化。線粒體融合是相鄰線粒體先后融合外膜和內(nèi)膜的過程，是修復(fù)受損線粒體的重要手段，參與該過程的膜蛋白主要是外膜MFN1/2和內(nèi)膜OPA1[29]。線粒體分裂方式分為中區(qū)分裂和外周分裂，中區(qū)分裂主要與DRP1有關(guān)[30]。研究表明，MFN2缺乏會導(dǎo)致兩個細胞器產(chǎn)生物理間隙，從而改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)并破壞這些細胞器之間的鈣轉(zhuǎn)移[31]，進而影響線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整性。另有研究表明，OPA1能維持緊密的嵴連接進而提高呼吸效率并支持呼吸鏈超復(fù)合物組裝[32]，且能降低器官對凋亡和氧化損傷的易感性[33]，從而維持體內(nèi)氧化還原平衡，減輕氧化應(yīng)激對器官的損害。此外，尿酸能顯著上調(diào)大鼠腎細胞中DRP1蛋白表達水平[34]。DRP1也參與過氧化物酶體分裂[29]。線粒體融合與分裂活動處于動態(tài)平衡中，當膜融合蛋白與分裂蛋白表達異常時，線粒體的自我修復(fù)能力減弱，其生物活性可能受到影響。本研究也發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥小鼠腎臟組織中線粒體MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白表達顯著減少，DRP1蛋白表達顯著增加，這說明線粒體的自我更新能力減弱和生物活性受損。四妙散可通過促進腎臟線粒體蛋白的表達，而發(fā)揮促進尿酸排泄和保護腎臟的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，四妙散能改善高尿酸癥小鼠的氧化還原平衡。其他團隊研究也發(fā)現(xiàn)，四妙散的主要藥材黃柏的水提取物和醇提取物可清除次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子和Fenton反應(yīng)生成的氧自由基[35]，黃柏的主要成分小檗堿能減少過氧化氫誘導(dǎo)的巨噬細胞線粒體ROS的生成[36]。此外，小檗堿和黃柏酮能夠調(diào)節(jié)線粒體的融合與分裂[37-38]。蒼術(shù)內(nèi)酯II能夠提高骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中SOD活力和GSH水平，降低MDA水平，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[39]。牛膝的重要成分蛻皮甾酮可能通過減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，增強抗氧化酶的功能，調(diào)節(jié)線粒體的功能，從而保護H9c2細胞[40]。薏苡仁含有豐富的多酚類化合物，并被證明其總抗氧化能力與之有顯著相關(guān)性[41]。這說明四妙散可能通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達以維持線粒體的功能，改善機體抗氧化應(yīng)激的能力，從而改善高尿酸血癥及其誘發(fā)的腎損傷。

綜上，本研究表明四妙散能改善高尿酸血癥小鼠的尿酸代謝，抑制腎臟損傷，其作用機制可能與抑制XOD活性，以及調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂，進而增強機體抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。本研究為四妙散治療高尿酸血癥的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，同時也為其他降血尿酸藥物的機制研究提供了策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of Simiao San on alleviation of hyperuricemia and renal injury and regulation of renal mitochondria related proteins

WANG Shan1, ZHANG Yue-yi1, LIU Tian-yuan1, LU Mei-xi1, DAI Xuan1, LIU Ya-ge1, ZHANG Yan-fei2, WANG Li-li3, ZHANG Dong-wei1

1. Diabetes Research Center, School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Department of Anatomy, School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 3. Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To explore the effect and possible mechanism of Simiao San (四妙散) on improving uric acid metabolism and kidney damage in hyperuricemia mice.The acute hyperuricemia mouse model was established with oteracil potassium (300 mg/kg) and hypoxanthine (500 mg/kg), and then the water extract of Simiao San (4.55, 9.1, 18.2 g/kg) was given for 7 d. The content of uric acid (UA) in serum and urine, the activities of superoxide dismutase (SOD) and contents of oxidized glutathione (GSSG), malondialdehyde (MDA) in serum, and reduced glutathione (GSH) level in kidney, and activity of xanthine oxidase (XOD) in liver were measured by biochemical method. Western blotting was used to detect the expressions of fusion and division related proteins in kidney mitochondria. The pathological changes of kidney was observed by HE staining.Simiao San significantly reduced UA content in serum of hyperuricemia mice (< 0.05, 0.01), significantly increased UA content in urine (< 0.05, 0.001), significantly increased SOD activity in serum and GSH level in kidney (< 0.05, 0.01, 0.001), significantly reduced GSSG and MDA levels in serum (< 0.05, 0.001), and significantly reduced XOD activity in liver (< 0.05). At the same time, Simiao San significantly increased renal mitofusin protein 1 (MFN1), MFN2, optic atrophy 1 (OPA1) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α (PGC-1α) protein expressions (< 0.05), reduced dynamin-related protein 1 (DRP1) protein expression (< 0.05), thereby inhibiting the pathological changes of the kidney.Simiao San can enhance ability of body to resist oxidative stress by regulating the expression of mitochondrial related proteins, thereby improving uric acid metabolism and inhibiting kidney damage.

Simiao San; hyperuricemia; renal injury; oxidative stress; mitochondrion

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4177 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.011

2022-12-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（81874373）；國家自然科學(xué)基金資助項目（82074235）

王 釤，女，碩士研究生，研究方向為中藥改善慢性代謝性疾病的作用機制。E-mail: ws1225751257@163.com

通信作者：王麗麗，講師，研究方向為中藥抗心血管和代謝性疾病。E-mail: liliw0108@163.com

張東偉，博士生導(dǎo)師，研究方向為內(nèi)分泌代謝性疾病的發(fā)病機制和中藥防治作用。E-mail: zhdw1006@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]