郭司群　遲曉雪　白雅靜

【摘要】目的：建立亞瑪丸中羥基紅花黃色素A的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2 C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇、乙腈和0.7%磷酸溶液進(jìn)行洗脫，流速為0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長403 nm。結(jié)果：羥基紅花黃色素A在2.01～30.15 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999，回收率為96.5%。結(jié)論：該方法經(jīng)方法學(xué)驗證準(zhǔn)確可行，可用于亞瑪丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；亞瑪丸；羥基紅花黃色素A

【中圖分類號】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）12-0030-03

Study on Determination of Hydroxysafflower Yellow A in Yama Pill GUO Siqun CHI Xiaoxue BAI Yajing

1.Hulunbeier Institute for Food and Drug Control，Hulunbeier 021008，China;

2.Hulunbuir Institute of Forestry and Grassland Science， Hulunbeier 021008，ChinaAbstract：Objective To establish a method for the determination of Hydroxysafflower yellow A in Yama pill. Methods high performance liquid chromatography was used. The column was SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2 C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）， the mobile phase was methanol acetonitrile 0.7% phosphoric acid solution， the flow rate was 0.8 mL/min， the column temperature was 35 ℃， and the detection wavelength was 403 nm. Results the linear relationship of Hydroxysafflower yellow A was good in the range of 2.01-30.15 μg/mL，r=0.9999，the recovery rate was 96.5%.Conclusion The method is proved to be accurate and feasible by methodology， and can be used for the quality control of Yama Pills.

Keywords：HPLC；Yama Pill；Hydroxysafflower Yellow A

蒙藥制劑亞瑪丸由制硼砂、熱制水銀、制硫磺、人工牛黃、草烏葉、訶子、翻白草、苘麻子、決明子、梔子、楓香脂、紅花、石菖蒲、山麥冬、沒藥、檀香、大托葉云實、木香、水牛角濃縮粉、丁香、文冠木、銀朱、川楝子、人工麝香二十四味藥組成。具有消“粘”，祛“亞瑪”病，清血，熱的功效，可用來治療“亞瑪”病諸癥［1］，風(fēng)濕，類風(fēng)濕，皮膚病，偏正頭疼、血熱頭疼，小腦刺痛，中風(fēng)初期，白脈病。蒙藥制劑是保障蒙醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的重要前提，其中制劑質(zhì)量控制又是保證蒙藥安全、有效的重要基礎(chǔ)［2］，由于亞瑪丸目前暫無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，無法有效控制制劑質(zhì)量，因此本實驗根據(jù)制劑功效選取組方藥材紅花作為制劑質(zhì)量控制藥材。紅花，性溫、味辛，具有通經(jīng)散瘀、消腫止痛的功效［3］。參考《中國藥典》2020年版一部中“紅花”項下的含量測定方法［4］，建立高效液相色譜法，對處方中紅花所含的羥基紅花黃色素A的含量測定進(jìn)行研究。

1儀器與材料

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；KQ2200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；賽多利斯BSA224S型、BP211D型電子天平（德國賽多利斯科技有限公司）；PB-10型酸度計（德國賽多利斯科技有限公司）。

亞瑪丸樣品由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供（批號：20191811、20200313、20200324）；羥基紅花黃色素A （批號：111637-202111，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇（色譜純 Fisher Chemical）；磷酸（分析純，天津科密歐試劑有限公司）；自制純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈（26∶2）為流動相A，0.7%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)制pH為6.0±0.1）為流動相B，A∶B（20∶80）；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：403 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備取羥基紅花黃色素A對照品4.12 mg，用25%甲醇稀釋制成4.12 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取上述丸劑研細(xì)，取約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入25%甲醇50 mL，密塞，稱取重量，超聲（功率350 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱取重量，以25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液制備取按處方配比并以同樣工藝生產(chǎn)的缺紅花的陰性供試品，按2.2.2項下供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。

2.3干擾試驗分別取2.2.1、2.2.2、2.2.3項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果表明：其他組分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾。結(jié)果如圖-1、圖-2和圖-3所示。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系精密稱取羥基紅花黃色素A對照品2.01 mg，用25%甲醇溶解制成每1 mL含羥基紅花黃色素A 40.20 μg的儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL和7.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成羥基紅花黃色素A的2.01 μg/mL、4.02 μg/mL、10.05 μg/mL、20.10 μg/mL和30.15 μg/m 1系列濃度溶液。按2.1項下色譜條件，以濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

2.4.2精密度試驗取2.2.1項下對照品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，記錄色譜峰面積，羥基紅花黃色素 A 峰面積的 RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測定，結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗取樣品（批號：20200313）供試品6份，各約2.0 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表3，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5回收率試驗取已知含量的樣品（批號：20200313，含量為0.063 mg/g）9份，各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入用25%甲醇配制的0.0326 mg/mL羥基紅花黃色素A對照品溶液1.5 mL、1.8 mL、和2.2 mL，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表4，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5樣品含量測定取三批樣品按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定。結(jié)果見表5。

3討論

3.1色譜條件的選擇參考2020年版《中國藥典》一部“紅花”含量測定項下流動相組成，分別考察甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶78）、甲醇-0.7%磷酸溶液（22∶78）、甲醇-0.7%磷酸溶液（20∶80）及2.1項下流動相比例時羥基紅花黃色素A的保留時間和分離情況，結(jié)果表明：以2.1項下流動相比例，羥基紅花黃色素A能與其他成分達(dá)到較好分離，且保留時間在20 min內(nèi)。采用紫外-可見分光光度計對2.2.1項下羥基紅花黃色素 A 對照品溶液在200～450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果在 402.5 nm處有最大吸收，因此選擇 403 nm 作為檢測波長。

3.2供試品溶液制備分別使用甲醇、25%甲醇、50%甲醇和水作為提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明25%甲醇提取量明顯高于其他三種提取溶劑。對加熱回流和超聲兩種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩種提取方法含量差異并不明顯，考慮操作的簡便性，最終選用超聲作為提取方法。同時又對超聲30 min、40 min和50 min進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲40 min時，羥基紅花黃色素A的提取量明顯高于30 min，與50 min差異不大，所以本次實驗選擇超聲時間為40 min。

綜上，研究建立的高效液相色譜法簡便可行、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于亞瑪丸的質(zhì)量控制。參考文獻(xiàn)

［1］石瑞平.蒙醫(yī)藥辨證治療亞瑪病的臨床體會［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2012，18（2）：17.

［2］董玉.基于質(zhì)量標(biāo)志物的蒙藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（1）：56-59.

［3］高海珣，楊秀芬.羥基紅花黃色素A藥理作用研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（19）：41-44.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：157-158.

（收稿日期：2022-10-14編輯：劉斌）