徐玉娟,何秀,李勝濤,譚潭（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院,湖南 郴州 423000）

兒童支氣管哮喘的早期診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估有助于改善預(yù)后，盡管臨床癥狀結(jié)合兒童較難配合完成的肺功能檢查和臨床常規(guī)白細(xì)胞、C-反應(yīng)蛋白等炎癥指標(biāo)在一定程度上基本能夠完成其輔助診斷和病情評(píng)估，但仍有近1/3患兒無(wú)法得到早期的明確診斷，使其成為了一項(xiàng)挑戰(zhàn)[1]。既往研究[2]發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和靶基因表達(dá)具有調(diào)控作用的微小RNA（micro-RNA，miRNA）在支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于血清miR-935和miR-22-3p在小兒支氣管哮喘患者中的表達(dá)水平及其與患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)性的研究報(bào)道甚少，故本研究旨在通過(guò)檢測(cè)小兒支氣管哮喘患者發(fā)作時(shí)血清miR-935和miR-22-3p的水平變化，分析其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，以期為小兒支氣管哮喘患者的臨床病情評(píng)估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將50例于2021年6月-2022年12月在我院診治的支氣管哮喘急性發(fā)作患兒作為觀察組研究對(duì)象，其中男孩27例，女孩23例，年齡0-12歲，平均年齡（5.24±3.09）歲。另選取同期50例來(lái)院健康體檢兒童作為對(duì)照組，其中男孩25例，女孩25例，年齡6-14歲，平均年齡（5.2±3.15）歲。觀察組患兒根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕度組（n=17）、中度組（n=18）和重度組（n=15），各組兒童在性別、年齡等資料方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病且未接受過(guò)規(guī)范化哮喘治療的0歲≤年齡≤12歲兒童；②支氣管哮喘及病情評(píng)估參照《支氣管哮喘基層診療指南（實(shí)踐版·2018）》[3]；③兒童家屬知情并同意本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他肺部疾病如感染性肺炎、肺氣腫、支氣管擴(kuò)張等；②肝、腎、心等其他系統(tǒng)受損者；③近一周服用過(guò)激素類(lèi)藥物患兒。

1.2 研究方法 體檢兒童在體檢當(dāng)天、觀察組患兒在接受治療前，均空腹?fàn)顟B(tài)抽取外周靜脈血3mL，離心后立即吸取分離后的血清分裝凍存在-80℃冰箱內(nèi)。采用第二代測(cè)序技術(shù)將獲得的支氣管哮喘患兒血清進(jìn)行miRNA差異表達(dá)譜檢測(cè)分析，初步篩查數(shù)具有差異表達(dá)的血清miR-935和miR-22-3p作為下一步生物信息學(xué)分析的標(biāo)志物并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[4-5]并設(shè)計(jì)PCR引物序列如下：miR-935正向引物（F）：5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTTACCGCTTC CGC-3′，反向引物（R）：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；miR-22-3p F：5′-CATTCAGCCAGTCTCCACGTGA-3′，R：5′-G C T T C C A G T G A T A C G G C C T G T A C G-3′；內(nèi)參U 6 F：5′-C T C G C T T C G G C A C G A C A-3′，R：5′-A A C G C T T C A G A A T T G C G T-3′。采用由1 0 u l TaqManGEMASTERMix、1ul產(chǎn)物、1ul引物和8ul無(wú)RNA酶水組成的20ul反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)95℃ 5min，95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 20s共40循環(huán)的擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，再根據(jù)內(nèi)參基因U6的表達(dá)量計(jì)算出ΔCt值，以2-ΔΔCt值作為目標(biāo)基因產(chǎn)物表達(dá)水平。比較兩組兒童及不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS28.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用(±s)表示，多組間行方差分析，兩組間行t檢驗(yàn)。診斷價(jià)值分析采用繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清miR-935和miR-22-3p水平比較 觀察組患兒血清miR-935表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而血清miR-22-3p表達(dá)水平呈相反趨勢(shì)，兩組間比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.786和5.975，P均＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 兩組兒童血清miR-935和miR-22-3p水平比較

2.2 不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平比較 輕度組、中度組和重度組患兒血清miR-935表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，而血清miR-22-3p表達(dá)水平呈相反趨勢(shì)，組間和組內(nèi)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同病情患兒血清miR-935和miR-22-3p水平比較

2.3 血清miR-935和miR-22-3p對(duì)兒童支氣管哮喘的診斷價(jià)值 繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)：血清miR-935、miR-22-3p及兩者聯(lián)合對(duì)兒童支氣管哮喘的診斷曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.772、0.785和0.825，診斷靈敏度為72.25%、75.00%和82.25%，診斷特異性為75.00%、77.25%和85.00%。

3 討論

在兒童中發(fā)病率占3%左右且有上升趨勢(shì)的支氣管哮喘的發(fā)生與家族遺傳、環(huán)境影響和免疫功能降低等多種因素相關(guān)，若未得到及時(shí)有效的治療，可誘發(fā)氣道狹窄，miRNA表達(dá)異常相關(guān)的體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制研究或可為支氣管哮喘的病情嚴(yán)重程度評(píng)估和通過(guò)靶基因?qū)ふ倚碌闹委煼绞教峁┛茖W(xué)依據(jù)[6-8]。

既往關(guān)于miR-935和miR-22-3p的研究大多集中在腫瘤和自身免疫性疾病，其可通過(guò)對(duì)白介素相關(guān)信號(hào)通路、絲裂原激活蛋白激酶和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控而發(fā)揮生物學(xué)作用[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患兒血清miR-935表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而血清miR-22-3p表達(dá)水平呈相反趨勢(shì)（P＜0.05），輕度組、中度組和重度組患兒血清miR-935表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)（P＜0.05），而血清miR-22-3p表達(dá)水平呈相反趨勢(shì)（P＜0.05），ROC曲線顯示血清miR-935、miR-22-3p及兩者聯(lián)合對(duì)兒童支氣管哮喘具有較高的診斷敏感性和特異性，表明血清miR-935在支氣管哮喘患兒中表達(dá)升高，而血清miR-22-3p表達(dá)降低，其水平的變化與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，對(duì)支氣管哮喘具有一定的診斷價(jià)值，這可能與miRNA調(diào)控不同信號(hào)通路而影響細(xì)胞因子表達(dá)從而在不同哮喘類(lèi)型中發(fā)揮作用有關(guān)，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究，或有望為靶向治療及探尋新型生物學(xué)標(biāo)志物作出貢獻(xiàn)[13]。