王坤，吳晗，唐慧敏

(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，南京 210000)

吡噻菌胺(penthiopyrad)是一種作用于病菌體內(nèi)琥珀酸脫氫酶的殺菌劑，由日本三井化學(xué)株式會(huì)社與美國(guó)杜邦公司共同研發(fā)，2008 年于日本獲得首次登記[1-2]。其主要靶向病原物的線粒體，通過(guò)抑制呼吸鏈電子傳遞，破壞病原物的三羧酸循環(huán)，降低其能量代謝，達(dá)到殺滅病原物目的[3-4]。吡噻菌胺化學(xué)結(jié)構(gòu)創(chuàng)新、殺菌譜廣，對(duì)引起菌核病、葉斑病、白粉病、果樹黑星病等病害的多種病原菌均表現(xiàn)出顯著的抑制效果[5]。

目前有關(guān)吡噻菌胺原藥的分析方法研究報(bào)道較少，本文采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)吡噻菌胺原藥中有效成分進(jìn)行分析研究，該方法快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確度高，分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度均能滿足農(nóng)藥質(zhì)量科研和抽檢分析檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 試劑和溶液

乙腈，色譜純(美國(guó)默克公司)；水，超純水；吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)品(已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)、99.0%吡噻菌胺原藥(意大利世科姆公司)。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1100 高效液相色譜儀，具有自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和Agilent Chemstation 色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)；Millipore 超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)；梅特勒XP205 分析天平(梅特勒-托利多儀器公司)。

1.3 液相色譜條件

ZORBAX SB-C18不銹鋼色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=70∶30(體積比)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫(溫度變化應(yīng)不大于2 ℃)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；保留時(shí)間：4.2 min。吡噻菌胺標(biāo)樣和原藥試樣的典型高效液相色譜圖見圖1、2。

圖1 吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖2 吡噻菌胺原藥高效液相色譜圖

1.4 測(cè)定步驟

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.000 2 g)，置于50 mL 容量瓶中，用乙腈溶解，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，稀釋至刻度，搖勻備用。

1.4.2 試樣溶液配制

稱取含吡噻菌胺0.01 g(精確至0.000 2 g)的試樣，置于50 mL 容量瓶中，用乙腈溶解，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，稀釋至刻度，搖勻備用。

1.4.3 儀器測(cè)定

按上述操作條件下，保持儀器穩(wěn)定后，使用自動(dòng)進(jìn)樣器連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至前后2 針吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積相對(duì)變化小于1.5%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行分析測(cè)定。

1.4.4 計(jì)算

將測(cè)得的2 針試樣溶液和試樣前后2 針標(biāo)樣溶液中吡噻菌胺峰面積進(jìn)行平均。試樣中吡噻菌胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計(jì)算：

式中：w1為試樣中吡噻菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A2為試樣溶液中吡噻菌胺峰面積平均值；m1為吡噻菌胺標(biāo)樣的質(zhì)量，g；w為吡噻菌胺標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中吡噻菌胺峰面積平均值；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

吡噻菌胺紫外光譜圖如圖3 所示，吡噻菌胺最大吸收波長(zhǎng)在230 nm 處，該處基本無(wú)干擾、靈敏度較高，故將檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為230 nm。

色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相不銹鋼色譜柱。依據(jù)吡噻菌胺的物化性質(zhì)，避免溶劑對(duì)目標(biāo)化合物干擾，選擇乙腈作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動(dòng)相，為達(dá)到更好分離效果，流動(dòng)相按照不同體積比例在上述色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)乙腈與水體積比為70∶30，流速為1.0 mL/min 時(shí)，有效成分與雜質(zhì)能很好的分離，峰形對(duì)稱，分離效果好，最終確定流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30(體積比)，流速1.0 mL/min。

圖3 吡噻菌胺紫外吸收光譜圖

2.2 方法線性相關(guān)性

配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2 mg/mL的吡噻菌胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合得到線性方程y=4 630.6x+175.65，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8(圖4)。結(jié)果表明，吡噻菌胺質(zhì)量濃度在0.1～2 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 吡噻菌胺質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系圖

2.3 方法精密度測(cè)定

從同一樣品中準(zhǔn)確稱取5 個(gè)平行樣品，按照1.4.2 節(jié)方法制備，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得吡噻菌胺原藥的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.11 和0.11%(表1)。結(jié)果表明，RSD值小于修改的Horwitz 公式2(1-0.5logC)×0.67，該方法精密度符合質(zhì)量檢測(cè)的相關(guān)要求，能夠滿足日常檢測(cè)需要。

表1 吡噻菌胺原藥中有效成分精密度測(cè)定

2.4 方法準(zhǔn)確度測(cè)定

按照1.4.2 節(jié)方法配制5 份吡噻菌胺原藥試樣溶液，分別添加一定量吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得吡噻菌胺的平均回收率為100.09%(表2)。結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度，滿足檢測(cè)吡噻菌胺原藥質(zhì)量分析要求。

表2 吡噻菌胺原藥中有效成分準(zhǔn)確度測(cè)定

3 結(jié)論

本文建立了吡噻菌胺原藥中有效成分含量的高效液相色譜分析方法。本方法線性關(guān)系良好，精密度、準(zhǔn)確度較高，具有快速、簡(jiǎn)便及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足吡噻菌胺原藥質(zhì)量檢測(cè)需求，是一種較為理想的分析檢測(cè)方法。