關艷玲,章萍萍,陳 秀,蔣勵萍,魏 偉,馬 旸

皮膚是一個復雜的器官,由表皮、真皮和皮下脂肪組織構成[1-2]。表皮細胞主要由角質形成細胞(keratinocyte,KC)構成,從基底層到角質層,KC呈現不同的增殖、遷移和分化等新陳代謝過程[3]。因小鼠背部皮膚生理結構與人類皮膚相似,所以常被用于皮膚相關動物實驗中[4]。原代KC提取方法主要包括:中性蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化法、中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法以及嗜熱菌蛋白酶消化法[5-7]。 胰蛋白酶作用于基底層細胞和棘層細胞,作用強度大,經濟有效且操作最為簡單方便。選擇哪種品系的小鼠提取原代KC最合適尚未有明確的研究,該研究選用4種品系的成年小鼠背部皮膚,使用胰蛋白酶消化法獲取原代KC,比較其增殖和分化能力,為皮膚相關疾病模型小鼠的品系選擇提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡BALB /c、C57BL/6、KM的雄性小鼠各5只,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。5只8周齡雄性BALB /c遺傳背景裸小鼠,由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供,生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0008,使用許可證號:SYXK(蘇)2018-0027。

1.2 主要試劑胰蛋白酶消化液(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)、青-鏈霉素抗菌溶液和BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司); 154完全培養(yǎng)基和生長因子(美國Gibco公司); DAPI 染色液及防熒光淬滅封片液(北京索萊寶生物公司);CCK-8(上海陶素生化公司);keratin 14(K14)抗體(美國 Proteintech 公司)。

1.3 主要儀器Infinite M1000 PRO 多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司;Image Xpress Micro 4型高內涵細胞成像分析儀購自美國 Molecular Devcies 公司。

1.4 成年小鼠背部皮膚表皮與真皮分離8周齡BALB /c、C57BL/6、KM、裸小鼠,剔除小鼠背部毛發(fā),脫毛膏涂抹3 min后去除,暴露皮膚組織,異氟烷吸入處死。器械經高壓滅菌后使用,所用試劑無菌,全程無菌超凈臺中操作,避免細胞污染。剪取背部皮膚,修剪成約3 cm×3 cm正方形,表皮朝下,用無菌注射器針頭固定在錫箔紙包裹的泡沫盒上,手術刀小心快速清理皮下脂肪組織和血管。75%乙醇清洗1次,含雙抗的dPBS清洗3 次。表皮向上放置在25 cm2培養(yǎng)皿中,加入適量胰蛋白酶消化液,4 ℃消化20 h。

1.5 成年小鼠背部皮膚表皮KC分離與原代培養(yǎng)取消化后的皮膚至無菌超凈臺,手術刀剝離表皮細胞,轉移表皮細胞至1.5 ml EP管中,加1 ml含2%血清的dPBS,剪碎后先后通過70、40 μm細胞過濾網,用2% dPBS重懸細胞至50 ml離心管中,同時用5 ml注射器軟活塞研磨;1 800 r/min離心5 min,棄上清液,1 ml 154完全培養(yǎng)基緩緩吹打重懸細胞,移入1.5 ml EP管中,計數。接種于6孔板,48 h后換液,用倒置顯微鏡對培養(yǎng)的原代KC進行觀察,并拍照記錄。

1.6 原代KC鑒定4% 多聚甲醛固定30 min;加 0.1% TritonX-100通透5 min;5% BSA 封閉 30 min;加入抗體K14,4 ℃ 孵育過夜;加熒光二抗室溫避光孵育1 h;DAPI 染細胞核,孵育5 min;正置顯微鏡觀察細胞染色情況并拍照。

1.7 CCK-8法檢測不同品系、不同種板密度原代KC活力原代KC以每孔不同梯度的細胞密度接種于96孔板。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,在不同時間加入CCK-8試劑與培養(yǎng)基1 ∶10的混合液,孵育3 h,酶標儀測量450 nm處的吸光度。

1.8 EdU法檢測原代KC增殖原代KC以每孔3.2×104的密度接種于24孔板,培養(yǎng)5 d后,加入EdU工作液孵育2 h;4% 多聚甲醛固定30 min;0.3%Triton-X100通透15 min;加入Click反應液室溫避光孵育30 min;Hoechst染核避光孵育10 min,顯微鏡下拍照。

1.9 高內涵細胞成像法檢測測原代KC增殖原代KC以每孔8×103密度接種于96孔板,培養(yǎng)72 h后,棄培基加PBS洗滌細胞;4%多聚甲醛固定 30 min,加 DAPI 染核,孵育5 min; PBS洗滌后用高內涵細胞成像系統(tǒng)拍照,統(tǒng)計細胞總數。

1.10 Western blot法檢測原代KC分化原代KC以每孔2×105密度接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h;棄培基加入蛋白裂解液,冰上裂解30 min,轉移至1.5 ml EP管中,加入5×上樣緩沖液,金屬浴煮蛋白8 min;進行蛋白免疫印跡檢測表達情況。

2 結果

2.1 4種不同品系的成年小鼠背部皮膚KC原代分離培養(yǎng)的對比

2.1.1胰蛋白酶消化法對4種品系成年小鼠背部皮膚消化時間比較 胰酶消化法分離4種品系成年小鼠背部表皮和真皮時,消化時間影響分離效果。胰蛋白酶分別消化BALB/c、C57BL/6 、KM、裸小鼠4種品系小鼠背部皮膚16、14、18、16 h時,手術刀片輕刮,可見表皮與真皮之間的連接開始松散,部分表皮與真皮分離。隨著消化時間的增長,達到最適消化時間,可完整剝離表皮,刮下一層致密排列的半透明狀薄層細胞,此時細胞狀態(tài)最佳。當4種品系小鼠背部皮膚消化時間分別超過24、22、26、24 h后,此時手術刀片可輕刮下一層柔軟絮狀無韌性細胞團,細胞存活率低。消化時間比較見表1。

表1 胰酶消化法對4種品系成年小鼠背部皮膚消化時間比較

2.1.2提取4種品系成年小鼠背部KC獲得的數量對比 利用胰蛋白酶消化相同面積(3 cm×3 cm)的小鼠背部皮膚,經20～22 h消化后,過濾獲得KC懸液,1 800 r/min離心5 min,1 ml 154完全培養(yǎng)基重懸可得原代KC。經計數可知C57BL/6小鼠來源的原代KC細胞數量最多,KM小鼠來源的原代KC細胞數量最少,消化獲得BALB/c、C57BL/6、KM、裸小鼠原代KC的細胞個數分別為4.2×106、4.8×106、3.6×106、4.0×106個/ml。

2.1.34種品系成年小鼠背部KC形態(tài)學觀察 提取的原代KC鋪板48 h后,顯微鏡下可觀察到3種形態(tài)的KC,包括懸浮的死亡細胞,半貼壁狀態(tài)的圓形的KC,以及貼壁狀態(tài)的鵝卵石樣KC。原代培養(yǎng)8 d后,鏡下可見多數鵝卵石樣KC,少量橢圓、扁平狀、中心有較大突出的細胞核,胞質面積大的處于分化后期的KC。見圖1。

圖1 4種品系成年小鼠原代KC生長狀況

2.2 原代KC的免疫熒光鑒定分化蛋白K14是表皮基底層KC的陽性標志物。將提取的原代KC通過免疫熒光染色檢測細胞K14表達情況,鏡下可見胞質綠色熒光為陽染細胞,結果顯示提取的細胞為基底層KC,符合KC特征,小鼠背部原代KC分離成功。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測原代KC中K14表達 ×200

2.3 4種品系原代KC最適宜接種密度的比較將提取的4種品系成年小鼠背部原代KC,以不同接種密度接種于96孔板。 CCK-8結果顯示,BALB/c、KM、裸小鼠來源的原代KC以8×103個/孔的密度鋪板增殖效率較高,而以1.6×104個/孔、3.2×104個/孔的密度鋪板時,此時的增殖活力低于以8×103/孔的密度鋪板的增殖活力,提示鋪板細胞密度太大可能導致細胞出現接觸抑制現象,使得細胞貼壁能力下降,細胞活力下降。C57BL/6來源的原代KC以1.6×104個/孔的密度鋪板增殖效率較高,而以3.2×104個/孔的密度鋪板時,此時的增殖活力稍低于以1.6×104個/孔的密度鋪板的增殖活力(圖3)。

圖3 4種品系小鼠背部原代KC以不同密度鋪板后增殖活力的變化

2.4 4種品系原代KC增殖能力比較

2.4.1CCK-8實驗 原代KC以8×103/孔的密度鋪板于96孔板,培養(yǎng)60 h后加CCK-8檢測450 nm處的吸光度,實驗結果見圖4,比較可知C57BL/6來源的原代KC較其他3種品系小鼠來源的原代KC其增殖活力更加顯著。

圖4 CCK-8檢測4種品系小鼠背部原代KC增殖能力統(tǒng)計圖

2.4.2EdU實驗 顯微鏡下觀察統(tǒng)計,綠色與藍色熒光重合的即為EdU陽性細胞。隨機選取 5個高倍視野,Image J和GraphPad Prism軟件統(tǒng)計EdU陽性細胞的百分率。EdU法測細胞增殖實驗結果顯示,在培養(yǎng)第5天時,C57BL/6來源的原代KC,其EdU陽性細胞率高于BALB/c、KM、裸小鼠來源的原代KC。見圖5。

圖5 EdU法測4種品系小鼠背部原代KC增殖能力

2.4.3高內涵實驗 高內涵細胞成像法檢測原代KC增殖能力,利用高內涵細胞成像軟件分析系統(tǒng),統(tǒng)計每孔細胞總數,通過比較細胞數量分析細胞增殖能力。結果如圖6所示,C57BL/6原代KC的增殖能力大于BALB/c原代KC(P<0.05),與EdU法結果一致,KM和裸小鼠原代KC的增殖能力處于C57BL/6和BALB/c之間。

圖6 高內涵檢測4種品系小鼠背部原代KC增殖能力

2.5 4種品系成年小鼠背部皮膚原代KC分化程度比較KC是構成表皮的主要細胞成分,在體內處于不斷增殖過程中,分裂的角化細胞主要位于其基底層,少數位于棘層。隨著向表層的推移,細胞的分化程度逐漸增加,并喪失分裂活性。Western blot檢測分化特異性角蛋白K1表達情況,結果顯示4種品系小鼠K1表達差異無統(tǒng)計學意義,說明提取的原代KC分化程度差異無統(tǒng)計學意義。見圖7。

圖7 4種品系小鼠背部原代KC角蛋白K1表達情況

3 討論

KC過度增殖和角化異常是銀屑病的病理表現[8],創(chuàng)面愈合和皮膚屏障[9-10]也與KC密切相關,所以原代KC的提取和培養(yǎng)的實驗技術是研究臨床皮膚相關疾病的基礎實驗。KC是表皮的主要細胞類型,其特點是在體外分裂率低,20世紀70年代以來,國內外學者經過多年的研究和探索,為解決原代KC體外增殖能力弱這一問題,不斷改進和優(yōu)化提取及維持培養(yǎng)條件,包括小鼠周齡、皮膚部位、消化酶、培養(yǎng)基、生長因子的優(yōu)化等[11-13],現在已經取得了很大進展。

小鼠周齡、皮膚部位、品系都會影響小鼠原代KC提取效率。新生小鼠皮膚提取的細胞產量高,表皮毛囊形成早期數量少,表皮和真皮分離難度較小,現已有較為完善的提取方式[5-6]。成年小鼠毛發(fā)呈周期性生長,分為生長期,衰退期,靜止期,選擇靜止期小鼠(通常是6～12周齡)最佳;成年小鼠背部皮膚很薄,表皮只有1～2層KC,提取產量較低,而且毛囊密度較高表皮真皮分離困難;尾部皮膚KC有3～5層,毛囊密度低,表真皮分離易。由此可見,相比于新生小鼠,成年小鼠原代KC的分離和培養(yǎng)難度更大,但就長遠的研究來看,克服成年小鼠原代KC分離培養(yǎng)的難題更具有意義。

該研究選擇了Lichti et al[6]研究的成年小鼠背部皮膚提取方法,采用低鈣無血清培養(yǎng)基,胰蛋白酶消化法(含EDTA)提取原代KC,EDTA不僅能破壞細胞間連接促進細胞解離,也能減少胰蛋白酶對細胞的損傷。該實驗主要研究常用的4種小鼠品系在該提取條件下,對原代KC的增殖和分化能力是否有影響。選用常用的幾種小鼠品系,BALB/c,C57BL/6,KM和裸小鼠,比較了成年小鼠背部提取原代KC的增殖、分化能力,結果顯示與C57BL/6小鼠比較,BALB/c小鼠原代KC增殖活力較低,這一結果提示,在BALB/c和C57BL/6中選擇研究原代細胞的相互作用時,C57BL/6是較好的品系選擇。此外,在原代KC提取過程中,該研究表明需要使用未反復凍融的胰蛋白酶,否則消化效果會變差,此外皮膚組織包含表皮、真皮以及皮下脂肪組織,分離表皮和真皮前需要把皮下脂肪組織清理干凈,這直接影響到表皮真皮分離時間和效果,比如KM小鼠皮膚皮下脂肪組織較其他3種品系的厚,完全去除困難,需要延長表皮真皮消化時間,該實驗探究了不同品系小鼠的最佳消化時間,為不同品系小鼠原代KC提取時間的選擇提供一定實驗依據,調整實驗細節(jié)從而獲取高活力的原代細胞。在原代KC培養(yǎng)過程中,該研究表明細胞增殖能力和接種細胞密度有關:細胞密度太低,單個細胞增殖速度緩慢,后期細胞無法增長死亡;細胞密度過高,細胞貼壁效率低增值能力低,加快細胞死亡速度。4種成年小鼠背部原代KC鋪板時都存在高密度鋪板增殖抑制甚至不增殖,低密度鋪板增殖抑制的現象,所以適宜的鋪板密度會增加細胞存活率,優(yōu)化鋪板密度提高存活率。

綜上所述,比較4種品系成年小鼠的增殖和分化能力,有助于為相關皮膚疾病提供技術基礎,為提取原代KC的小鼠的品系選擇提供實驗依據。