趙正陽,李笑秋

放療(radiotherapy,RT)是腫瘤局部治療的重要手段,具有組織深度穿透、定位精確和可控等優(yōu)點,但同時也存在對正常組織的損傷以及腫瘤的輻射抵抗等限制因素[1-2]?？朔鲜鱿拗埔蛩氐某Ｓ梅椒ㄊ鞘褂梅暖熢雒魟┰黾幽[瘤組織的放射敏感性,降低正常組織的毒性,從而提高放療療效。Au納米顆粒是常見的納米化重金屬放療增敏劑之一[3],具備良好的腫瘤富集特性,其放療增敏能力與自身粒徑大小有關,小粒徑Au納米顆粒擁有更強的輻射沉積能力[4]。然而隨著Au納米顆粒粒徑的減小,其本身的生物毒性則會變的越來越明顯,使得其進一步的臨床轉化得到限制[5-6]。該研究通過利用Uio-66-NH2金屬有機框架作為載體材料負載小粒徑Au納米顆粒(粒徑為15 nm)來有效解決這一問題。

1 材料與方法

1.1 材料儀器四氯化鋯(zirconium tetrachloride,ZrCl4)購自上海麥克林生化科技股份有限公司;2-氨基對苯二甲酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;N,N二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、冰醋酸、水合四氯金酸(Trichlorogold hydrochloride hydrate,H3AuCl4O)購自上海國藥集團化學試劑有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胰酶(濃度0.25%)購自美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司;CCK-8試劑購自北京蘭杰柯科技有限公司;6～8周齡的雌性Balb/c小鼠購自杭州子源實驗動物科技有限公司。JEM-F200透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)購自日本JEOL公司; Malvern ZS90動態(tài)光散射儀(dynamic light scattering,DLS)購自英國Malvern Instruments公司;UV-2802PC紫外可見分光光度計(Ultraviolet-visible Spectrophotometer,UV-Vis)購自美國UNICO公司。

1.2 方法

1.2.1Au@Uio-66-NH2納米顆粒的制備 將1 ml氯金酸水溶液 (0.025 mol/L)加入到100 ml去離子水中,之后加熱至100 ℃。向溶液中加入3 ml枸櫞酸鈉水溶液(0.034 mol/L),邊加熱邊攪拌20 min,得到深紅色的枸櫞酸穩(wěn)定的Au納米顆粒。然后,將得到的溶液冷卻至室溫,加入10 mg硫辛酸聚乙二醇(lipoic acid-polyethylene glycol,LA-PEG),攪拌過夜。最后將其分散在1 ml DMF中。將分散在DMF中的1 ml Au納米顆粒、27.3 mg 2-氨基對苯二甲酸以及1.2 ml冰醋酸加入到7 ml DMF中,在超聲波下攪拌15 min。同時,在超聲波作用下將33.4 mg四氯化鋯分散在7 ml DMF中,得到均勻的分散液。然后,將上述兩種溶液混合在25 ml反應釜中,加熱至120 ℃并維持24 h,然后用DMF洗滌多次,最后分散在去離子水中常溫保存。

1.2.2Au@Uio-66-NH2納米顆粒表征測定 取8 μl含Au@Uio-66-NH2納米顆粒的水溶液置于圓形銅片上,干燥過夜后使用TEM觀察Au@Uio-66-NH2顆粒的形態(tài),用GraphPad Prism V8.0軟件處理圖片。將Au@Uio-66-NH2納米顆粒水溶液置于DLS儀器內(nèi),檢測納米顆粒尺寸分布以及Zeta電勢,之后每隔5 d對同一批次的Au@Uio-66-NH2納米顆粒水溶液進行粒徑檢測,評價納米顆粒在水溶液中的穩(wěn)定性。利用UV-Vis對Au@Uio-66-NH2納米顆粒水溶液進行紫外光譜分析,用GraphPad Prism V8.0軟件處理上述數(shù)據(jù)。分別取500 μl Au納米顆粒及Au@Uio-66-NH2納米顆粒溶液置于玻璃瓶中,加入5 ml硝酸,加熱板300 ℃煮至液體即將蒸發(fā)完時停止反應,加入500 μl王水,并用去離子水定容至3 ml,電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)檢測樣品中Au的濃度。

1.2.3細胞培養(yǎng) 4T1小鼠乳腺癌細胞取自美國典型培養(yǎng)庫(ATCC),培養(yǎng)在含1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)及10%胎牛血清的DMEM當中,并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育。當細胞生長至對數(shù)生長期時(密度長至培養(yǎng)皿80%左右),用胰酶消化細胞,用于后續(xù)傳代、種板及植瘤。

1.2.4CCK-8實驗評估Au@Uio-66-NH2納米顆粒與Au納米顆粒的生物安全性 當細胞處于對數(shù)生長期時,用胰酶消化培養(yǎng)皿底部細胞,離心后重懸制成細胞懸液。用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù),以5×103個/孔的密度將細胞鋪入96孔板內(nèi),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。之后分別加入含不同Au濃度(0、25、50、75、100 μg/ml)的Au@Uio-66-NH2納米顆粒以及Au納米顆粒的培養(yǎng)基,并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后取出96孔板,棄去原培養(yǎng)基,每孔加入100 μl含有CCK-8試劑的培養(yǎng)基(CCK-8試劑與DMEM培養(yǎng)基體積比為1 ∶10),然后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,最后用酶標儀檢測每組在450 nm處的吸光度,根據(jù)公式:存活率=(實驗組-空白對照組)/(陰性對照組-空白對照組)×100%計算細胞存活率,并利用Excel 2013和GraphPad Prism V8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行作圖處理。

1.2.5CCK-8探究放療后不同時間點Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用 取對數(shù)生長期細胞,將細胞分為3組:空白對照組(不含納米顆粒且不放療)、單純放療組(不含納米顆粒)以及納米顆粒聯(lián)合放療組(Au@Uio-66-NH2納米顆粒中Au濃度為50 μg/ml),以5×103個/孔的密度傳至96孔板中,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。24 h后棄去原培養(yǎng)基,每組作不同處理。繼續(xù)孵育4 h后給予6 Gy劑量的放射治療,治療后4 h更換新鮮培養(yǎng)基并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。依次在放療后24、48、72 h用CCK-8試劑檢測每組的細胞存活率,同時用Excel 2013和GraphPad Prism V8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行作圖處理,對每組數(shù)據(jù)進行對比。

1.2.6克隆形成實驗探究在不同放療劑量下不同濃度Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用 對6孔板按放療劑量梯度(0、2、4、6 Gy)以及Au@Uio-66-NH2納米顆粒中Au濃度梯度(25、50、100 μg/ml)進行分組,每孔種植1 000個細胞。在培養(yǎng)箱孵育過夜后每組作不同處理,繼續(xù)孵育4 h后分別給與不同劑量的放射治療,治療后 4 h更換新鮮培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。5 d后取出6孔板,棄去原培養(yǎng)基,1×PBS每孔清洗1遍,4%PFA固定細胞55 min,之后用1×PBS再次清洗3遍。結晶紫染色45 min,最后用1×PBS清洗5遍,拍照計數(shù),并利用Excel 2013和GraphPad Prism V8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行作圖處理。

1.2.7構建4T1小鼠腫瘤模型 所有動物均按《實驗動物飼養(yǎng)使用指南》的規(guī)定飼養(yǎng),并符合中國科學技術大學動物保護使用委員會的要求。將懸浮于100 μl 1×PBS的5×105個4T1細胞接種于Balb/C小鼠右側背部皮下,構建小鼠4T1荷瘤模型。

1.2.8驗證體內(nèi)Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用以及生物安全性 將小鼠分為4組:空白對照組(Ⅰ組),單純納米顆粒組(Ⅱ組),單純放療組(Ⅲ組),納米顆粒聯(lián)合放療組(Ⅳ組)(n=4)。當荷瘤小鼠皮下腫瘤長至50 mm3左右時,第Ⅱ組與第Ⅳ組小鼠尾靜脈注射含Au@Uio-66-NH2納米顆粒的等滲液(5 mg/kg)。12 h后第Ⅲ組與第Ⅳ組小鼠給與6 Gy劑量的放射治療,之后每2天測量1次小鼠腫瘤大小以及小鼠體質量,腫瘤體積計算公式:腫瘤體積(mm3)=0.5×長度×寬度2。在放療后第18天用頸椎脫位法處死小鼠,取出小鼠皮下腫瘤以及主要臟器。腫瘤拍照稱重后與主要臟器一同用4%PFA進行固定,48 h后用石蠟包埋,之后對組織作HE染色處理,并用全景掃描顯微鏡觀察染色結果。

2 結果

2.1 Au@Uio-66-NH2納米顆粒的表征透射電鏡圖顯示每個Au@Uio-66-NH2納米顆粒的大小基本一致,粒徑在100 nm左右,Au納米顆粒被穩(wěn)定的包裹在Uio-66-NH2當中,如圖1A所示。DLS測得的粒徑主要分布在100 nm左右,這與透射電鏡觀察的結果相一致,如圖1B所示;測得的電勢為17 mV,如圖1C所示。對于Au@Uio-66-NH2納米顆粒在水溶液中的長期粒徑監(jiān)測結果顯示粒徑基本穩(wěn)定在100 nm左右,體現(xiàn)出該顆粒在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性,可以長期在水溶液里儲存,如圖1D所示。紫外光譜分析能夠明顯看到Au@Uio-66-NH2納米顆粒在530 nm波長處有一處明顯的波峰,為Au元素的特征峰,進一步證實了Au納米顆粒被成功組裝進Uio-66-NH2內(nèi),并具有良好的穩(wěn)定性,如圖1E所示。ICP-MS測量Au納米顆粒及Au@Uio-66-NH2納米顆粒中Au的含量分別為790.18 μg及770.43 μg。

圖1 Au@Uio-66-NH2納米顆粒相關表征圖

2.2 Au@Uio-66-NH2與Au納米顆粒毒性檢測探究上述Au@Uio-66-NH2納米顆粒與Au納米顆粒的體外生物安全性,分別檢測與不同濃度Au@Uio-66-NH2納米顆粒以及Au納米顆粒(0、20、50、75、100 μg/ml,以Au濃度作為標準)孵育24 h后的4T1細胞存活率,如圖2所示。結果顯示不同濃度Au@Uio-66-NH2組的4T1細胞存活率均未有明顯下降,而同等濃度Au組的細胞存活率明顯降低,并且隨著濃度的增加,兩者的差異逐漸增大,當濃度為100 μg/ml時,Au組的細胞存活率只有60.98%,遠低于Au@Uio-66-NH2組細胞存活率85.85%(P<0.05),實驗表明Au@Uio-66-NH2納米顆粒有效緩解了Au納米顆粒的細胞毒性作用。

圖2 不同濃度Au@Uio-66-NH2納米顆粒與Au納米顆粒的細胞毒性比較

2.3 CCK-8法及克隆形成實驗評估Au@Uio-66-NH2納米顆粒放療增敏效應進一步研究Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用,比對不同時間段各組處理后的CCK-8結果,如圖3A所示,隨著放療后時間的延長,RT組與Au@Uio-66-NH2+RT組的細胞存活率在不斷降低,且Au@Uio-66-NH2+RT組的治療效果優(yōu)于RT組,在放療后72 h,Au@Uio-66-NH2+RT組細胞存活率僅有62.86%,低于RT組的細胞存活率70.33%(P=0.017 4,t=3.255),表明Au@Uio-66-NH2納米顆粒在體外具有良好的放療增敏效果。

圖3 體外實驗驗證Au@Uio-66-NH2納米顆粒放療增敏作用

進一步驗證不同Au@Uio-66-NH2納米顆粒濃度以及不同放療劑量對增敏效果的影響,采用克隆形成法對比不同處理組最終的細胞集落數(shù)量,如圖3B所示。從圖中數(shù)據(jù)可以看出Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用具有濃度依賴性,高濃度顆粒組的細胞集落數(shù)量明顯少于低濃度顆粒組以及RT組的細胞集落數(shù)。并且隨著放療劑量的提高,Au@Uio-66-NH2納米顆粒的增敏效果也越強,其中在6 Gy放療劑量下,2組療效最佳,細胞存活率僅有22.67%,故選用6 Gy作為后續(xù)體內(nèi)治療實驗的放療劑量(圖3C)。

2.4 Au@Uio-66-NH2納米顆粒體內(nèi)放療增敏效果驗證通過構建小鼠乳腺癌模型,進一步探究納米顆粒的體內(nèi)放療增敏作用,如圖4所示。Au@Uio-66-NH2+RT組的小鼠腫瘤生長速度明顯低于RT組,在治療第18天納米顆粒聯(lián)合放療組小鼠腫瘤生長抑制率為67.86%,高于RT組腫瘤生長的抑制率48.95%(F=93.70,P=0.011 6),如圖4A所示。對各組小鼠的體質量進行長期監(jiān)測,各組小鼠間體質量未見明顯差異,再次驗證Au@Uio-66-NH2納米顆粒具有良好的生物安全性,如圖4B所示。在治療后第18天處死小鼠,取出各組小鼠的皮下腫瘤,進行拍照,如圖4D所示。之后稱量各組小鼠腫瘤的質量,結果顯示Au@Uio-66-NH2+RT組小鼠腫瘤質量明顯低于RT組(F=35.57,P=0.016 6),而Au@Uio-66-NH2組與PBS組相比腫瘤質量未見明顯差異,進一步說明了Au@Uio-66-NH2納米顆粒本身不具有明顯的細胞毒性作用,如圖4C所示。最后對取出的腫瘤及臟器作HE染色處理,如圖4E所示,納米顆粒聯(lián)合放療組腫瘤組織壞死區(qū)域更大,而各組小鼠之間主要臟器染色比對結果并未顯示出明顯差異,進一步在組織水平上證實了Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用以及良好的生物安全性。

圖4 體內(nèi)實驗驗證Au@Uio-66-NH2納米顆粒放療增敏作用及生物安全性

3 討論

放射治療是目前主要的癌癥治療方式之一,但是由于放療對周圍正常組織的損傷以及腫瘤異質性等原因造成的輻射抵抗,限制了放療的療效。為了在最大限度減少正常組織暴露的同時給予腫瘤組織更多的放療劑量,人們對放療技術進行了不斷的改進,例如近距離放射療法、三維適形調強放療、圖像引導放射治療以及立體定向消融放療等。盡管上述技術的改進極大促進了放療的療效,但仍然存在著一些影響療效的因素,例如腫瘤異質性,腫瘤區(qū)域血管分布的改變、代謝變化等[7]。而放療增敏劑可以在一定程度上克服上述問題對療效帶來的負面影響,簡要補充現(xiàn)有放療增敏劑應用現(xiàn)狀及局限性。納米材料具有的優(yōu)勢在于,由于高滲透長滯留效應的存在,其能夠在腫瘤區(qū)域高度富集,而很少聚集在正常組織當中,并且它的大小和形狀易于操控,其表面還可以通過修飾賦予不同的功能從而進一步提高放療效率。由于納米材料這些獨特的理化性質,使得其被廣泛用于腫瘤的放療增敏[8]。其中具有高Z值的重金屬納米顆粒作為主要的放療增敏手段之一,其作用機制是由于X射線的吸收系數(shù)會因原子序數(shù)Z的改變而產(chǎn)生顯著的變化,隨著Z值的增高,X射線的吸收效率也會明顯增加[9]。Au納米顆粒作為高Z值納米材料的一員,具有化學穩(wěn)定性好、制備容易、生物相容性高等特點,在各類腫瘤當中都表現(xiàn)出了良好的放療增敏效果。在對Au納米顆粒放療增敏效應的不斷探究中顯示小粒徑Au納米顆粒具有更強的放療增敏能力,然而其生物毒性作用相對于較大粒徑Au納米顆粒也變的更加明顯,不利于臨床應用。

金屬有機骨架是由有機配體和金屬離子在配位鍵的驅動下自組裝而成的高度結晶的多孔材料,由于其具有高比表面積,被認為是一種很有前途的新型載藥材料[10]。Uio-66-NH2是一種基于鋯元素的金屬有機框架,由于其原料便宜,反應簡單,不需要額外的表面修飾,并且具有低細胞毒性和相對較高的生物相容性等特點,在近期受到越來越多人的重視。已有多篇文獻[11-12]報道了Uio-66-NH2作為藥物載體在腫瘤化療、放療及光熱治療領域所發(fā)揮的積極作用。該研究將Uio-66-NH2作為Au納米顆粒的載體,采用CCK-8細胞毒性檢測方法表明了Au@Uio-66-NH2納米顆粒改善了小粒徑Au納米顆粒的細胞毒性,并且在后續(xù)的體外和體內(nèi)實驗均表明了Au@Uio-66-NH2納米顆粒的放療增敏作用以及良好的生物安全性。

綜上所述,該研究通過將Au納米顆粒組裝進Uio-66-NH2的多孔結構中,有效降低了Au納米顆粒的生物學毒性,并同時保留了Au納米顆粒的放療增敏作用,具有良好的臨床轉化潛力。