吳婧婧,黃 琦,彭 瑤,楊 洋

肝癌作為全球范圍內(nèi)最常見的癌癥之一,發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最常見的病理類型,約占90%。盡管傳統(tǒng)化療、肝動(dòng)脈化療栓塞、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑等療法,一定程度上延長(zhǎng)了患者的生存期,但總體預(yù)后仍較差。因此,迫切需要尋找有效的治療方法。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages, TAM)是腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的一類重要免疫細(xì)胞,以M2型為主,而CD163為目前公認(rèn)的M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物[2]。分泌性磷蛋白1 (secreted phosphoprotein 1, SPP1) 廣泛存在于人體的組織與器官內(nèi),其表達(dá)在多種腫瘤中均顯著上調(diào)[3-5],巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)SPP1的結(jié)腸癌患者的無進(jìn)展生存期 (progression free survival, PFS)更短[6]。但目前在HCC中針對(duì)SPP1的研究較少,且發(fā)揮作用機(jī)制尚不完全清楚。程序性死亡因子配體-1(programmed death receptor ligand-1, PD-L1)是程序性死亡因子-1(PD-1)的配體,B7超家族i型跨膜糖蛋白。PD-L1 在人體的多種免疫及腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)[7-9],促進(jìn)活化 T 細(xì)胞凋亡,抑制活化 T 細(xì)胞增殖。但HCC的免疫微環(huán)境中SPP1和PD-L1在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞參與腫瘤免疫過程中發(fā)揮何種相互作用尚不明確。該研究將探索HCC中SPP1、PD-L1與M2巨噬細(xì)胞的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性,從而為靶向M2巨噬細(xì)胞治療HCC提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料該研究整群收集2017—2019年在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院初次診斷并接受手術(shù)的81例HCC患者和10例癌旁組織(對(duì)照組)的石蠟標(biāo)本,取分界線以外相應(yīng)一側(cè)2 cm的組織為癌旁組織。全組病例需符合的條件有:① 手術(shù)前未接受過放療或化療;② 年齡、性別、BCLC分期等資料完整;③ 標(biāo)本組織經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科專家再次確診為HCC。HCC病人肝組織石蠟切片中男70例,女11例,年齡30～78 (58.2±11.6)歲。其中,年齡≥60歲以上的患者38例(46.9%);BCLC分期A期57例(70.3%),B期14例(17.3%),C期10例(12.3%),無D期患者;肝臟單發(fā)腫瘤68例 (84.0%),多發(fā)腫瘤13例 (16.0%);腫瘤直徑>5 cm 46例(56.8%),腫瘤直徑≤5 cm 35例 (43.2%);有HBV感染患者71例(87.7%),無HBV感染患者10例(12.3%)。

1.2 試劑與儀器CD163(美國Santa Cruz公司);SPP1(江蘇親科生物研究中心有限公司);PD-L1(英國Abcam公司);石蠟切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,RM2016); 脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司,JJ-12J), 數(shù)字切片掃描儀Pannoramic MIDI(匈牙利3DHISTECH公司);光學(xué)顯微鏡(重慶重光實(shí)業(yè)有限公司,COIC,XSP-C204)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化檢測(cè)肝組織石蠟切片SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá) HCC組織經(jīng)甲醛固定、梯度乙醇脫水后,將組織和石蠟置于包埋框內(nèi),冷卻后即成蠟塊。進(jìn)行防脫處理后,Leica石蠟切片機(jī)切成厚4～6 μm薄片,將蠟片裱貼于載玻片上,烤干待用。免疫組化法染色按MaxVision二步法進(jìn)行,具體操作參照說明書。以磷酸鹽緩沖液(PSB)代替一抗作陰性對(duì)照,已知陽性切片為陽性對(duì)照。在光學(xué)顯微鏡(COIC公司,XSP-C204)下結(jié)合常規(guī)HE切片觀察免疫組化切片的染色反應(yīng)。數(shù)字切片掃描儀下進(jìn)行拍照。

觀察 SPP1、PD-L1和CD163在細(xì)胞中的染色情況,在細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色著色為陽性細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分。① 按染色強(qiáng)度記分: 無色0分, 淡黃色1分, 棕黃色2分, 棕褐色3分; ② 按陽性細(xì)胞率計(jì)分:陽性細(xì)胞率≤4%(0分),5%～24%(1分),25%～49%(2分),50%～74%(3分),陽性細(xì)胞率≥75%(4分),兩者結(jié)果相乘即為總評(píng)分,總評(píng)分≤1分為陰性,2～4分為弱陽性,5～8分為中等陽性,9～12分為強(qiáng)陽性。在該研究中將陰性和弱陽性定義為低表達(dá),中等陽性和強(qiáng)陽性定義為高表達(dá)。

1.3.2隨訪 隨訪方式為電話隨訪,截止時(shí)間為2022年4月30日。該研究中有 79例患者取得完整隨訪資料?？偵鏁r(shí)間為手術(shù)時(shí)間到死亡或隨訪截止時(shí)間。到隨訪截止時(shí)間未死亡的患者定義為結(jié)尾數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用四格表的χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法分析兩種蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系。兩種蛋白與生存期分析采用Kaplan-Meier 法對(duì)總生存期 (overall survival, OS) 繪制生存曲線,并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)影響,生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素采用單因素和多因素Cox回歸模型。采用χ2檢驗(yàn)分析兩種蛋白之間及與M2巨噬細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性。當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPP1、PD-L1和CD163在肝癌中的表達(dá)81例HCC患者組織中,高表達(dá)SPP1、PD-L1和CD163的患者例數(shù)分別為39 (48.1%),32 (39.5%)和38 (48.1%),高于癌旁組織 (P<0.05 )。見圖1。

圖1 SPP1、 PD-L1和CD163在HCC、癌旁組織中的表達(dá) ×100

2.2 SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)與HCC患者臨床特征的關(guān)系SPP1、PD-L1和CD163的高表達(dá)與HCC患者BCLC分期均相關(guān)(P<0.05),與年齡、性別均無關(guān)(P>0.05)。同時(shí),SPP1的表達(dá)還在腫瘤直徑大、肝內(nèi)多發(fā)腫瘤的HCC中患者中增高;PD-L1的表達(dá)在肝內(nèi)多發(fā)腫瘤、有HBV感染的HCC患者中增高(P<0.05)。見表1。

表1 HCC組織中SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 SPP1和PD-L1在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性及與HCC患者生存的相關(guān)性(包括單因素、多因素生存分析)

2.3.1SPP1和PD-L1在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性 39例SPP1高表達(dá)的HCC患者中有21例PD-L1高表達(dá),SPP1和PD-L1在HCC組織中呈正相關(guān) (c=0.272,P=0.011)

2.3.2生存因素分析 對(duì)81例HCC病例進(jìn)行單因素COX回歸模型分析,結(jié)果顯示BCLC分期、SPP1高表達(dá)和PD-L1高表達(dá)均與HCC患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05),將上述因素納入多因素COX回歸模型分析,結(jié)果顯示BCLC分期、SPP1高表達(dá)和PD-L1高表達(dá)均是影響預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。見表2、3。

表2 81例HCC患者預(yù)后的單因素COX回歸模型

表3 81例HCC患者預(yù)后的多因素COX回歸模型

2.3.3SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)與HCC患者生存情況的關(guān)系 81例患者中79例患者隨訪,其中73例患者在隨訪期內(nèi)死亡(94.9%),死因均與腫瘤相關(guān)。全組患者3年生存率為24%,SPP1, PD-L1和CD163的高表達(dá)均與預(yù)后相關(guān)(P<0.01,P<0.01,P=0.01)。見圖2。

圖2 SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)與HCC患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.4 SPP1和PD-L1與肝癌組織M2巨噬細(xì)胞的相關(guān)性39例HCC組織SPP1高表達(dá)患者中有30例CD163高表達(dá),SPP1和CD163在HCC組織中呈顯著正相關(guān) (r=0.485,P<0.001);32例HCC組織PD-L1高表達(dá)患者中有20例CD163高表達(dá),PD-L1和CD163在HCC組織中呈顯著正相關(guān) (r=0.226,P=0.038)。

3 討論

HCC是消化系統(tǒng)常見腫瘤,其病因至今尚不完全明確,缺乏有效治療手段,總體預(yù)后不佳,因此迫切需要新的治療方法。腫瘤微環(huán)境主要指腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞(免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞)及細(xì)胞外成分(細(xì)胞因子及趨化因子,細(xì)胞外基質(zhì)等)相互作用形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)等主要免疫細(xì)胞組成了腫瘤免疫微環(huán)境[10]。巨噬細(xì)胞是單核細(xì)胞系的分化細(xì)胞,不同微環(huán)境中,表現(xiàn)為不同亞型,主要分為M1和M2型。一般認(rèn)為TAM更接近于M2表型,可被IL-10、IL-13、IL-4激活,具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用[11-12]。

課題組前期研究[13]表明,晚期HCC患者的M2巨噬細(xì)胞表達(dá)增多,該研究表明M2巨噬細(xì)胞在HCC患者腫瘤組織中的高表達(dá)明顯高于癌旁組織,同時(shí)在腫瘤直徑大、BCLC分期晚的患者中表達(dá)升高。其機(jī)制可能為晚期HCC患者中β2-AR表達(dá)升高,下游cAMP/PKA/CREB和cAMP/IL-6/STAT3信號(hào)通路被激活,使M2巨噬細(xì)胞分泌促腫瘤細(xì)胞因子如IL-6等增多,促進(jìn)了肝癌進(jìn)展。但是否有其他機(jī)制作用于M2巨噬細(xì)胞,影響肝癌進(jìn)展仍需深入研究,本文進(jìn)一步研究了SPP1、PD-L1與M2巨噬細(xì)胞及與預(yù)后的相關(guān)性。

SPP1是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分,由多種細(xì)胞分泌,包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、平滑肌、淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞。在多種腫瘤的腫瘤組織和血清中SPP1的表達(dá)上調(diào)與患者不良預(yù)后相關(guān)[14-16]。有研究[17]表明,在肺腺癌中,SPP1可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2型極化,但具體機(jī)制尚不清楚,在HCC中研究較少。該研究表明,SPP1在HCC患者腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織,在BCLC分期晚、腫瘤直徑大、肝內(nèi)多發(fā)腫瘤病灶的患者中升高,且為肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素,高表達(dá)SPP1的患者生存期短于低表達(dá)患者。同時(shí),SPP1的表達(dá)與M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān),提示針對(duì)SPP1靶點(diǎn)的治療可能是改善HCC患者預(yù)后的潛在治療方案。

PD-L1在腫瘤免疫逃逸中起關(guān)鍵作用,靶向PD-L1已成為多種癌癥的一線治療方法[18]。研究[19]表明,抑制SPP1下游Cdk5基因的表達(dá)可減弱腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá),并促進(jìn)抗腫瘤免疫。本研究中,PD-L1的表達(dá)與HCC患者的年齡和性別無明顯相關(guān),在肝內(nèi)多發(fā)腫瘤、有HBV感染的HCC患者中增高,且為HCC患者預(yù)后獨(dú)立因素,PD-L1高表達(dá)HCC患者生存期較低表達(dá)患者縮短。PD-L1的表達(dá)與SPP1的表達(dá)、M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果為今后在HCC治療中,聯(lián)合使用SPP1抑制劑和PD-L1抑制劑提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述,該研究表明了HCC患者中SPP1、PD-L1和CD163的異常高表達(dá),并且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān),臨床監(jiān)測(cè)SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)有助于預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后。同時(shí)SPP1、PD-L1和CD163的表達(dá)有一定的相關(guān)性,提示SPP1和PD-L1可能通過對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用影響HCC發(fā)生發(fā)展。通過抑制SPP1和PD-L1的表達(dá)干預(yù)HCC腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的極化過程,可能為今后HCC的靶向治療及免疫治療提供有利的理論依據(jù)。