周 靜,胡冰琪,黃俊峰,劉 宇,王南楠,陳禮文

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞增殖、分化和生長至關(guān)重要的信號(hào),其突變激活與肺腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[1-2]。中國肺腺癌患者中,EGFR突變率高達(dá)45%～55%。常見的EGFR突變有EGFR19缺失(19 Del)及21點(diǎn)突變(21 L858R),這兩種突變?cè)谒蠩GFR突變中約占50%和40%[3]。目前中國臨床腫瘤協(xié)會(huì)推薦EGFR突變的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)作為一線治療藥物。但肺腺癌EGFR基因突變及其靶向藥物治療與腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)性尚不明確。該研究通過分析初診以及EGFR-TKIs靶向治療后EGFR基因突變肺腺癌患者腦轉(zhuǎn)移比例,結(jié)合體外EGFR-TKIs敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)差異進(jìn)行機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性收集2018年1月—2022年3月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的肺腺癌患者病例資料。納入標(biāo)準(zhǔn):① 經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌;② 所有患者均進(jìn)行基因檢測;③ 所有患者均通過MRI、CT檢查明確是否腦轉(zhuǎn)移。剔除標(biāo)準(zhǔn):① 其他部位的原發(fā)腫瘤;② 臨床資料不完整。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞系H3255(21 L858R)購自上海富衡細(xì)胞庫;PC9(19 Del)購自北京沃比森科技有限公司;吉非替尼(Gefitinib)(10 mg/支)(貨號(hào)SML1657)購自美國Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640及DMEM培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份公司;胎牛血清購自南京維森特生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自北京蘭杰柯科技有限公司;青-鏈霉素混合溶液、胰酶購自上海碧云天生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 將Gefitinib溶于DMSO中,形成10 mmol/L的原液于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?同時(shí)將原液分別稀釋為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 μmol/L。實(shí)驗(yàn)中各組DMSO溶劑均濃度不超過0.1%。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞H3255、PC9分別用RPMI-1640及高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清、1%雙抗(50 U/ml青霉素和0.05 mg/ml鏈霉素)。并將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)后傳代。

1.3.3CCK-8法測Gefitinib對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度IC50取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞,100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,分別加入100 μl不同濃度的Gefitinib溶液,培養(yǎng)箱中孵育72 h后加入含有10% CCK-8的完全培養(yǎng)基溶液,再次放入培養(yǎng)箱孵育1 h后,酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料的分析該研究共納入肺腺癌患者410例,年齡24～92(63±11)歲。其中在發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的患者中,年齡≤60歲有69例(43.4%),年齡>60歲患者84例(33.5%),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.103,P=0.043);淋巴結(jié)N2～3與淋巴結(jié)N0～1的患者分別為135例(39.7%),18例(25.7%),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.511,P=0.028);而腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率在性別、吸煙史、原發(fā)病灶大小及原發(fā)病灶T之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 410例肺腺癌患者臨床特征 [n(%)]

2.2 EGFR突變與患者腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)性410例患者中發(fā)生EGFR突變(19 Del/21 L858R)222例,EGFR野生型188例,兩者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移分別為85例(38.3%)和68例(36.1%),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.195,P=0.695)。EGFR突變和野生型腺癌患者在肝、骨、胸膜、腎上腺等轉(zhuǎn)移比率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR基因突變與肺腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析[n(%)]

2.3 EGFR突變亞型與肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)性104例EGFR 19 Del患者中,發(fā)生腦轉(zhuǎn)移31例(29.8%);118例EGFR 21 L858R患者中,發(fā)生腦轉(zhuǎn)移54例(45.8%),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.965,P=0.015)。EGFR 19 Del和21 L858R患者發(fā)生肝、骨、胸膜、腎上腺等部位轉(zhuǎn)移比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。將年齡、EGFR突變亞型、淋巴結(jié)等腦轉(zhuǎn)移影響因素進(jìn)行多因素分析顯示,EGFR 21 L858R(OR=2.393;CI=1.335～4.291;P=0.003),年齡≤60歲(OR=1.884;CI=1.054～3.376;P=0.033)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N2～3(OR=3.429;CI=1.444～8.143;P=0.005)是肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(圖1)。

圖1 影響肺腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生的Logistic回歸分析

表3 EGFR突變亞型與肺腺癌常見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)性 [n(%)]

2.4 EGFR基因與腦轉(zhuǎn)移病灶相關(guān)性EGFR突變型和野生型肺腺癌患者中,多發(fā)性腦轉(zhuǎn)移灶(>3個(gè))患者分別為45例(53%)和17例(25%)(χ2=12.237,P<0.001)。EGFR突變亞型中,19 Del和21 L858R患者腦轉(zhuǎn)移病灶呈多發(fā)灶(>3個(gè))分別有11例(34.4%)和34例(64.2%),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.101,P=0.008),提示EGFR突變型尤其是EGFR 21 L858R更傾向于多發(fā)病灶性轉(zhuǎn)移。見表4。

表4 EGFR基因突變與腦轉(zhuǎn)移病灶相關(guān)性分析[n(%)]

2.5 EGFR基因型與初診腦轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析在初診腦轉(zhuǎn)移患者中,EGFR野生型與突變型發(fā)病比例分別為18.6%(35/188)和21.6%(48/222),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.569,P=0.451)。EGFR突變亞型中,19 Del和21 L858R的患者腦轉(zhuǎn)移比例分別為13.5%(14/104)和28.8%(34/118),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.688,P=0.006)。見表5。

表5 EGFR基因型與初診腦轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析[n(%)]

2.6 EGFR-TKIs靶向治療后腦轉(zhuǎn)移時(shí)間分析EGFR突變的患者接受EGFR-TKIs靶向治療后,分別有17例19 Del和20例21 L858R患者進(jìn)展為腦轉(zhuǎn)移,其腦轉(zhuǎn)移中位數(shù)時(shí)間(月)分別為15(8.50, 25.00)和7(4.25, 12.25),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013),提示21 L858R患者接受EGFR-TKIs靶向治療后腦轉(zhuǎn)移時(shí)間顯著短于19 Del患者(圖2)。

圖2 EGFR基因突變患者靶向治療后腦轉(zhuǎn)移時(shí)間

2.7 Gefitinib抑制肺腺癌PC9、H3255細(xì)胞的增殖為探討EGFR-TKIs靶向治療后21 L858R更易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制,該研究采用梯度濃度的Gefitinib處理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)細(xì)胞72 h,CCK-8法檢測細(xì)胞存活率并計(jì)算IC50值。相比Gefitinib未處理組細(xì)胞,Gefitinib以濃度依賴方式抑制H3255和PC9細(xì)胞增殖。計(jì)算H3255和PC9細(xì)胞的IC50分別為(0.150±0.040)和(0.037±0.008) μmol/L(P=0.007),提示攜帶19 Del的PC9細(xì)胞比H3255(21 L858R)細(xì)胞對(duì)Gefitinib更敏感。見圖3。

圖3 不同濃度Gefitinib處理2種肺腺癌細(xì)胞的生存能力及IC50

3 討論

該研究對(duì)410例肺腺癌患者的分析表明,年齡≤60歲和淋巴結(jié)N2～3分期是腦轉(zhuǎn)移高危因素。這與Ji et al[4]及吳炳群 等[5]研究結(jié)果一致,Ji et al[4]研究表明年齡≤60歲、非鱗狀細(xì)胞癌患者更易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移;吳炳群 等[5]研究也表明年齡≤60歲和N分期越晚的NSCLC患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,該研究揭示了肺腺癌腦轉(zhuǎn)移患者的臨床特征,同時(shí)提示在臨床工作中需重點(diǎn)關(guān)注符合此特征的患者,提前預(yù)防治療。該研究表明初診的EGFR 21 L858R患者較19 Del更易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,但EGFR野生型及突變型患者腦轉(zhuǎn)移比例無顯著差異,提示21 L858R也是肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的一個(gè)危險(xiǎn)因素。Enomoto et al[6]研究也表明EGFR野生型與突變型肺腺癌患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率無顯著差異,但Wang et al[7]研究表明EGFR突變的晚期非鱗狀細(xì)胞肺癌患者腦轉(zhuǎn)移累積發(fā)病率顯著高于非突變患者,提示在突變類型的患者中需重點(diǎn)關(guān)注21 L858R患者。同時(shí)在臨床工作中可以依據(jù)該研究的3個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,對(duì)患者腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估及預(yù)測。該研究表明,在EGFR野生型與突變型之間以及21 L858R與19 Del之間其他遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移包括骨、肝、腎上腺和胸膜轉(zhuǎn)移無顯著差異。而Doebele et al[8]表明EGFR突變的NSCLC患者傾向肝轉(zhuǎn)移,不傾向骨、腎上腺、腦等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果與該研究不一致的原因可能是由于病例資料選擇的不同所致,該研究僅納入肺腺癌中晚期患者,而該研究納入標(biāo)準(zhǔn)是所有非小細(xì)胞肺癌患者。

該研究對(duì)EGFR突變亞型與腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率關(guān)系進(jìn)行分析顯示,在222例EGFR突變的患者中21 L858R的患者比19 Del更易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,但是對(duì)于其他遠(yuǎn)處病灶的轉(zhuǎn)移無明顯差異性。唐珊珊 等[9]研究表明21 L858R患者較19 Del更易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,研究結(jié)果與該研究基本一致。為探討此種差異形成的原因,該研究采用梯度濃度的Gefitinib處理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)細(xì)胞72 h,研究表明PC9細(xì)胞對(duì)Gefitinib的IC50顯著低于H3255細(xì)胞,提示PC9細(xì)胞對(duì)Gefitinib的敏感性高于H3255細(xì)胞。該研究推測治療后21 L858R的患者容易出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的原因可能是不同突變對(duì)靶向藥物治療的藥物療效不同所致。該研究通過臨床數(shù)據(jù)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示在臨床工作中應(yīng)該個(gè)體化治療,精準(zhǔn)的打擊癌癥,從而實(shí)現(xiàn)最佳醫(yī)學(xué)治療效果,使患者生存期得到最大延長。目前已有研究[10-11]表明2個(gè)突變亞型對(duì)EGFR-TKIs治療敏感性不一致,19 Del對(duì)EGFR-TKIs敏感性更好,有更長的無進(jìn)展生存時(shí)間、總生存期和良好的治療反應(yīng)。另外,該研究考慮EGFR-TKIs治療后腦轉(zhuǎn)移發(fā)病率可能受回顧性研究時(shí)間橫斷面的影響,導(dǎo)致患者觀察時(shí)間不一致,造成一定的誤差,因此,該研究暫未比較治療后腦轉(zhuǎn)移發(fā)病率。

該研究表明,肺腺癌EGFR突變患者多發(fā)性腦轉(zhuǎn)移灶(>3個(gè))發(fā)生率顯著高于野生型患者;在EGFR突變亞型中,21 L858R較19 Del患者更易出現(xiàn)多發(fā)(>3個(gè))腦轉(zhuǎn)移病灶,提示EGFR突變尤其是EGFR 21 L858R傾向于多發(fā)病灶性腦轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果與Enomoto et al[6]和Shin et al[12]基本一致,但前者觀察21 L858R與19 Del腦轉(zhuǎn)移灶的中位數(shù)分別為9.5(5～14)和12(1～12)(括號(hào)內(nèi)為病灶數(shù)目范圍),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯?1 L858R和19 Del患者的最少轉(zhuǎn)移灶分別為5和1個(gè),而該研究以3個(gè)為界限值,這可能是導(dǎo)致研究結(jié)果差異的原因。該研究表明肺腺癌EGFR突變與腦轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目的相關(guān)性。

綜上所述,年齡≤60歲、淋巴結(jié)N2～3分期以及EGFR 21 L858R突變是肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的高危因素。21 L858R突變患者接受EGFR-TKIs靶向治療后進(jìn)展為腦轉(zhuǎn)移的中位時(shí)間顯著短于19 Del,可能與二者對(duì)靶向藥物的敏感性有關(guān)。該研究為肺腺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及個(gè)體化靶向治療提供臨床依據(jù)。