尹雪莉,賈 波,劉 莉,李明聰,張 軍,楊 振,白紅枚,胡偉康,張素梅,張勝權

人白細胞介素(interleukin, IL)-10屬于II類IL-10家族細胞因子,細胞因子家族包括IL-19、IL-20、IL-28A、IL-28B以及 IL-29等。IL-10由Th2細胞分泌,抑制Th1細胞分泌細胞因子[1]。其基因定位于1號染色體(1q32.1),編碼17～20 ku糖蛋白[1-2]。IL-10受體由α、β兩個亞單位組成,廣泛表達于多種組織、細胞,包括皮膚角質形成細胞[3]。IL-10通過與其受體激活JAK-STAT、PI3K、MAPK等信號途徑調節(jié)免疫功能,主要表現(xiàn)為抑制IL-1α、 IL-1β、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-18、 IL-23、TNF-α等炎癥因子表達[4]。研究[5]表明IL-10與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關,包括銀屑病。銀屑病是炎癥性皮膚疾病,以皮膚角質形成細胞過度增殖及分化不全為特征,目前認為其發(fā)病機制是細胞免疫介導的自身免疫性疾病;免疫細胞及皮膚角質形成細胞分泌的促炎癥因子,包括TNF-α、IL-17和IL-22,促進皮膚角質形成細胞過度增殖及抑制分化。而IL-10能抑制這些促炎因子的分泌,理論上是潛在的銀屑病治療的靶點[5]。在銀屑病皮損中,IFN-γ和TNF-α呈現(xiàn)高表達,而Th2細胞分泌IL-4和IL-10因子相對表達不足[6];此外,研究[7-8]顯示,IL-10啟動子區(qū)域的多態(tài)性與銀屑病的發(fā)病相關,但IL-10在皮膚組織中的作用仍不十分清楚。該研究主要探討IL-10對皮膚角質形成細胞的增殖及分化等影響,初步揭示IL-10在銀屑病發(fā)病中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco 公司);0.25%胰酶、青-鏈霉素溶液、細胞周期試劑盒(上海碧云天生物技術公司); IL-10 (美國Peprotech 公司);AKT、磷酸化 AKT (pAKT)、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1 /2 (pERK1/2)(美國 Sant Cruz 公司); PD98059 、LY294002(美國 Sigma公司); TRIzol、SYBR Green 染料、RT-qPCR 擴增試劑盒(日本 TaKaRa 公司); Real-time 引物(上海生工生物工程技術服務有限公司);MTS試劑盒(美國Promega公司);HaCaT 永生化角質細胞為本實驗室保存。

1.2 引物從數(shù)據庫National Center for Biotechnology Information (nih.gov) 檢索獲得相關基因序列,Premier 7.0 設計引物,引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 將對數(shù)期HaCaT 細胞0.25%胰酶消化接種于6孔板中,用含 5% 胎牛血清,1% 雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基,在 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2MTS檢測細胞增殖 將對數(shù)期HaCaT 細胞0.25%胰酶消化計數(shù)每孔接種5 000個細胞于96孔板中,以0、3、10、30 ng/ml濃度的IL-10處理HaCaT細胞,分別在時間點(0、24、48、72 h)每孔加入20 μl MTS,孵育30 min后,置于酶標儀中檢測450 nm處吸光度值。

1.3.3流式細胞儀分析細胞周期 將對數(shù)期HaCaT 細胞用0.25%胰酶消化接種于6孔板中, 10 ng/ml的IL-10處理HaCaT細胞24、48 h,依據細胞周期試劑盒說明書,分別收集細胞;細胞固定:加入1 ml冰浴預冷70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4 ℃固定30 min預冷PBS洗2次;每管細胞加入500 μl碘化丙啶(PI)染色,常溫避光30 min,流式細胞儀上機檢測。

1.3.4RT-qPCR檢測K1、K5、Involucrin mRNA水平表達 HaCaT細胞接種12孔板,次日換液;特異性抑制劑(PD98059 70 μmol/L LY294002,32 μmol/L)培養(yǎng)1 h, 然后加入IL-10 (10 ng/ml) 培養(yǎng)1 h,加入1.2 mmol/L CaCl2繼續(xù)培養(yǎng)12 h,TRIzol 提取細胞總RNA,逆轉錄后得到cDNA,以此為模板,按照 TaKaRa 公司的說明書配好反應體系。預變性:95 ℃、30 s,循環(huán)1次;PCR反應:95 ℃、5 s,60 ℃、20 s, 循環(huán)40次。數(shù)據根據2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計處理。

1.3.5Western blot 分析相關蛋白水平 用不同濃度的IL-10處理HaCaT細胞, 提取總蛋白,蛋白定量后,加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃,煮沸5 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白; 將蛋白轉移至PVDF膜; 5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜; 一抗pERK1 /2(1 ∶500)和 pAKT(1 ∶500)及Actin(1 ∶1 000), 4 ℃過夜; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育 2 h; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;濾紙吸干,涂ECL 發(fā)光劑,曝光、拍照、Image J 圖像軟件分析各目的蛋白水平變化。

2 結果

2.1 IL-10對HaCaT細胞增殖的影響為了探討IL-10是否體外影響HaCaT細胞增殖,以圖中所示濃度及時間用IL-10處理HaCaT細胞,結果顯示在以0、3、10、30 ng/ml的IL-10處理的HaCaT分別與同時間點(0、24、48、72 h)的對照組(0 ng/ml, IL-10)相比其細胞增殖未見顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 MTS分析IL-10對HaCaT細胞增殖調控結果(n=6)

2.2 IL-10對HaCaT細胞周期的影響為了進一步驗證IL-10對HaCaT細胞增殖的影響,該實驗以10 ng/ml的IL-10處理HaCaT細24、48 h, PI染色后,流式細胞儀檢測IL-10對HaCaT細胞周期的影響。如圖2所示,IL-10處理HaCaT細胞24和48 h,與對照組(0 ng/ml)相比,10 ng/ml IL-10處理的HaCaT,其細胞各期(G1、S、G2)細胞數(shù)量百分比未見顯著性差異,提示IL-10對HaCaT細胞周期無顯著性影響。

圖2 流式細胞術分析IL-10對HaCaT細胞周期的調控(n=3)

2.3 IL-10上調CaCl2誘導的HaCaT細胞分化標志物INV的表達為了探究IL-10對HaCaT細胞分化的影響,加入IL-10(終濃度10 ng/ml)處理HaCaT 1 h后,加入或不加CaCl2,終濃度為1.2 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,Western blot檢測HaCaT角質形成細胞的分化標志物(K1表達于顆粒層;K5表達于基底層;Involucrin表達于棘層),IL-10(10 ng/ml)能夠協(xié)同CaCl2誘導的HaCaT角質形成細胞分化標志物Involucrin的表達,如圖3所示,單獨IL-10處理24 h內對Involucrin沒有顯著影響,單獨CaCl2處理24 h上調Involucrin的表達,而IL-10處理48及72 h,IL-10可以誘導Involucrin表達,且與CaCl2有協(xié)同效應。IL-10單獨處理HaCaT細胞24 h,上調K5差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但48、72 h表達水平略有降低,而對K1表現(xiàn)為抑制。

圖3 IL-10上調經CaCl2誘導的HaCaT角質形成細胞分化標志物(n=3)

2.4 IL-10通過PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑調控HaCaT角質形成細胞分化的作用為了探討IL-10調控HaCaT細胞分化標志蛋白分子表達的分子機制,IL-10(10 ng/ml)刺激HaCaT細胞不同時間, Western blot分析IL-10是否激活 PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑,與對照組(相同培養(yǎng)條件未加IL-10), IL-10分別在15和30 min開始顯著增加pAKT及pERK1/2的水平,分別在45和120 min達到峰值,而對總AKT及ERK1/2沒有顯著性影響,提示IL-10能夠激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2。同時特異性抑制劑PD98059(MAPK抑制劑)或LY294002(AKT抑制劑)能夠阻斷IL-10對PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途徑的激活效應。見圖4。

圖4 IL-10誘導AKT及ERK1/2磷酸化(n=3)

2.5 特異性抑制劑預處理后IL-10對HaCaT角質形成細胞分化的影響IL-10能夠激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2信號途徑,為了探討IL-10促進HaCaT細胞分化蛋白表達是否依賴其激活該2條信號途徑,以特異性抑制劑 (PD98059或LY294002) IL-10(10 ng/ml)單獨或聯(lián)合處理HaCaT細胞12 h,RT-qPCR 檢測分化標志物的mRNA水平相對表達,Western blot檢測分化蛋白標志物表達,抑制劑及IL-10同樣處理48 h,分析分化標志物的蛋白水平表達。結果顯示PD98059能夠顯著抑制IL-10單獨或與CaCl2聯(lián)合誘導的Involucrin及K1 mRNA和蛋白質水平表達,PD98059對CaCl2單獨誘導的Involucrin、K1及K5表達沒有顯著影響,PD98059單獨處理也顯著抑制Involucrin、K1及K5 mRNA及蛋白水平表達;LY294002則對各組均顯著抑制(圖5)。

圖5 特異性抑制劑檢測IL-10對HaCaT角質形成細胞分化影響(n=3)

3 討論

IL-10是一種多功能細胞因子,調控多種細胞的生物學行為,包括免疫及上皮細胞。該研究表明IL-10能上調HaCaT角質形成細分化標志物Involucrin,表現(xiàn)出與鈣離子的協(xié)同效應,其可能的機制是IL-10部分通過MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信號途徑發(fā)揮其上調CaCl2誘導HaCaT角質細胞分化的作用。

IL-10具有免疫抑制作用的多功能免疫調節(jié)因子,如抑制樹突細胞炎癥因子的生成及抗原遞呈作用,然而IL-10表現(xiàn)出促進CD8+T細胞的細胞毒活性,因此,IL-10如何發(fā)揮其作用可能與周圍的微環(huán)境相關[1-2,5],研究[9]表明IL-10受體廣泛表達于多種細胞,包括皮膚角質形成細胞。銀屑病主要以皮膚角質形成細胞過度增殖和分化不全為特征[10]。本研究顯示IL-10體外不影響人皮膚角質形成細胞HaCaT細胞的增殖,但是促進HaCaT細胞分化標志物的表達,提示其抑制銀屑病發(fā)病的機制不僅由于其抑制免疫細胞分泌炎癥細胞因子,可能還直接作用于皮膚角質形成細胞發(fā)揮促分化作用。研究[11-12]表明IL-10在銀屑病皮損中低表達,臨床試驗顯示銀屑病皮損局部注射IL-10能夠緩解銀屑病的癥狀。因此,IL-10是否通過促進皮膚角質形成細胞分化改善銀屑病癥狀還有待于進一步研究。

該研究表明IL-10能夠激活HaCaT細胞的PI3K-AKT及MAPK信號途徑,并且其促進HaCaT細胞的分化部分依賴MAPK及PI3K-AKT途徑。研究[13-14]表明MAPK-ERK及PI3K-AKT激活能夠促進皮膚角質形成細胞的分化,這與IL-10激活MAPK-ERK及PI3K-AKT進而促進HaCaT分化結果一致。研究[15-16]表明ERK 信號途徑 和 PI3K信號途徑參與了人皮膚角質形成細胞增殖與分化的調節(jié),ERK1/2激活誘導KCs細胞分化,而PI3K激活維持分化KCs的存活,從而使得皮膚角質形成細胞在增殖與分化之間達到平衡。 此外,IL-10還能激活JAK-STAT細胞途徑[1-2],提示IL-10對HaCaT細胞增殖及分化的影響機制可能涉及多條信號途徑,是多條信號途徑激活后的綜合效應,有待進一步研究。