陳文澤,鄒多宏,2

由牙周炎癥、外傷、感染等原因造成的牙槽骨骨量不足使得口腔種植體在植入后無(wú)法實(shí)現(xiàn)充分的骨整合,從而不利于口腔種植術(shù)后獲得良好的預(yù)后[1]。引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration, GBR)技術(shù)是臨床上治療牙槽骨缺損常用且有效的方法之一,通過(guò)屏障膜隔絕骨缺損區(qū)域外非成骨細(xì)胞向缺損區(qū)域的遷移,從而為缺損區(qū)域內(nèi)骨組織的形成提供了空間,因此,屏障膜在GBR技術(shù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。理想的GBR屏障膜應(yīng)具備良好的機(jī)械性能、生物相容性、生物可降解性以及一定的促成骨能力等特性[3],如何獲得兼具這些特性的GBR屏障膜仍是亟待解決的問(wèn)題。該實(shí)驗(yàn)使用絲素蛋白 (silk fibroin, SF) 制備了雙層絲素蛋白膜,并在其粗糙面上負(fù)載褐藻多酚 (phlorotannins, PT),使該膜兼具生物可降解性、良好的抗拉強(qiáng)度、良好的生物相容性以及促進(jìn)人牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的能力,可作為新型骨組織工程生物屏障膜使用。

1 材料與方法

1.1 合成材料蠶繭(浙江久恒蠶絲制品經(jīng)營(yíng)部);碳酸鈉、溴化鋰(美國(guó) Sigma-Aldrich公司);MWCO 3500透析袋(美國(guó) Pierce公司);褐藻多酚(陜西帕尼爾公司)

1.2 主要試劑與儀器α-MEM、胰酶消化液、青-鏈霉素溶液、BCIP/BNT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);活死細(xì)胞染色試劑盒(美國(guó) Proteintech公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所);PCR引物(上海生物工程股份有限公司);CO2孵育箱、酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社);高溫高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1人牙槽骨骨髓干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 門診收取18～24周歲女性患者骨阻生第3磨牙時(shí)去除的牙槽骨,放入取材液(含5%青-鏈霉素雙抗溶液的α-MEM的培養(yǎng)基)中,冰盒內(nèi)保存。用含有2%雙抗的PBS沖洗3次,用無(wú)菌手術(shù)刀片清除附著軟組織,用組織剪分離骨松質(zhì)并剪碎,5 d后首次換液,以后每3 d換液1次,培養(yǎng)10～12 d獲得P0代。將獲得的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增,計(jì)數(shù),將細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩Ｈ〉?代hABMSCs供實(shí)驗(yàn)用。

1.3.2制備SF溶液 蠶繭在0.02 mol/L碳酸鈉溶液中煮沸30、60、90 min后在蒸餾水中沖洗3次,每次30 min進(jìn)行脫膠處理。脫膠后的蠶絲干燥12 h后在60 ℃的9.3 mol/L溴化鋰溶液中溶解4 h,所得的溶液裝入MWCO 3500透析袋內(nèi)在蒸餾水中透析2 d。最后將透析袋內(nèi)的溶液移入離心管,18 000 r/min離心2次,每次20 min,收集上清液。

1.3.3制備PT-SF雙層膜 將SF溶液澆鑄于亞克力板上,室溫放置24 h后成膜,真空水蒸氣處理24 h,取出后固定于不銹鋼板上,在膜上涂布SF溶液,放入-80 ℃冰箱,使不銹鋼板與冰箱隔板緊密接觸,冷凍過(guò)夜后將其轉(zhuǎn)入凍干機(jī)凍干,再經(jīng)真空水蒸氣處理24 h獲得SF雙層膜。將3.5 μg的PT溶解于1 ml無(wú)水乙醇中制備PT溶液,按照6.5 μl/cm2的比例在SF雙層膜的粗糙面上滴加PT溶液,放置在生物安全柜中直到干燥,并保存在-80 ℃冰箱中供后續(xù)使用。

1.3.4力學(xué)測(cè)試 將不同脫膠時(shí)長(zhǎng)的SF雙層膜裁剪為長(zhǎng) 100 mm、寬10 mm 的測(cè)試樣品,浸泡于PBS內(nèi)室溫過(guò)夜,并通過(guò)力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)以 0.01 mm / s 的拉伸速度勻速拉伸直至樣品斷裂,測(cè)量其室溫條件下的濕態(tài)抗拉強(qiáng)度,每組樣品重復(fù)測(cè)試 5次。

1.3.5結(jié)構(gòu)表征 取抗拉強(qiáng)度最大的SF雙層膜所對(duì)應(yīng)的SF溶液重新制備膜樣品。低真空下噴金后使用掃描電鏡在15.0 kV的加速電壓下拍攝樣品的光滑面與粗糙面,取PT粉末、SF膜和PT-SF雙層膜采用傅立葉變換紅外光譜儀分析各成分。

1.3.6細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn) 按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO/EN10993-12)規(guī)定提取SF雙層膜與PT-SF雙層膜的浸提液,將高溫高壓消毒后的各組樣品浸泡于含10 %胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的α-MEM培養(yǎng)基內(nèi)24 h,樣品與培養(yǎng)基比例為1 g/10 ml[4]。在96孔板內(nèi)接種細(xì)胞,每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)副孔,每孔接種1× 104個(gè)hABMSCs。接種24 h后更換培養(yǎng)基,對(duì)照組使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng),SF組與PT-SF組使用對(duì)應(yīng)的浸提液培養(yǎng),此后每3 d換液1次。在1、4、7、14 d時(shí)分別棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2次,每孔加入CCK-8溶液(CCK-8 ∶DEME=1 ∶9)100 μl,37 ℃孵育2 h后使用酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm處的吸光度值。

1.3.7細(xì)胞活力及細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn):將SF雙層膜、PT-SF雙層膜制備成直徑10 mm的圓形樣品。在每個(gè)樣品上接種5× 104個(gè)hABMSCs,空白組將細(xì)胞接種于24孔板底,每組3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后按照活死細(xì)胞染色試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行染色操作,使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察;細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn):將PT-SF雙層膜制備成直徑6 mm的圓形樣品。在每個(gè)樣品的粗糙面上接種1×104個(gè)hABMSCs,48 h后,PBS清洗3遍,用4 %多聚甲醛固定樣品30 min后PBS清洗3遍,使用掃描電鏡拍攝樣品。

1.3.8細(xì)胞成骨分化的檢測(cè) qRT-PCR:將1×105個(gè)hABMSCs分別接種在SF雙層膜和PT-SF雙層膜的粗糙面上,細(xì)胞接種24 h后吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次后每孔加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基1 ml,此后每3 d更換1次,在成骨誘導(dǎo)第7天時(shí)用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA并根據(jù)試劑說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),RUNX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2, RUNX2)和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix, OSX)基因表達(dá)水平(引物序列見表1)。ALP染色與茜素紅染色:將消毒后的各組樣品分別浸泡于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)24 h,樣品與培養(yǎng)基的比例為1 g/10 ml,獲得浸提液。將hABMSCs接種于12孔板內(nèi),每孔1×105個(gè),24 h后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或相應(yīng)浸提液,每3 d換液1次,7 d后采用ALP染色的方法檢測(cè)ALP活性,14 d后采用茜素紅染色的方法檢測(cè)鈣鹽沉積情況。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同脫膠時(shí)間的絲素蛋白溶液制備的膜抗拉強(qiáng)度的比較圖1A為分別由脫膠時(shí)間30、60、90 min的絲素蛋白溶液制備而成的絲素蛋白雙層膜在濕態(tài)條件下的拉伸曲線;隨著脫膠時(shí)間從30、60 min增加至90 min,絲素蛋白雙層膜的抗拉強(qiáng)度從 (3.293±0.122 8)、(2.649±0.096 6)MPa 降低至(2.077±0.181 3) MPa(圖1B)。

圖1 SF雙層膜的抗拉強(qiáng)度測(cè)試

2.2 樣品表征掃描電鏡可見SF雙層膜光滑面表面致密光滑 (圖2A),粗糙面疏松多孔(圖2B),截面可見粗糙面呈縱向有序多孔的結(jié)構(gòu) (圖2C);與SF相比,在PT-SF中氫鍵和N-H伸縮振動(dòng)由3 275移動(dòng)至3 274 cm-1,C-H伸縮振動(dòng)由2 937移動(dòng)至2 930 cm-1,C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)由1 514移動(dòng)至1 512 cm-1(圖2D)。這表明PT可能通過(guò)氫鍵、疏水作用等作用力與SF發(fā)生了相互作用,從而結(jié)合到了SF雙層膜的粗糙面上。

圖2 SF雙層膜及PT-SF雙層膜的微觀結(jié)構(gòu)及成分分析

2.3 細(xì)胞黏附能力及PT-SF雙層膜生物相容性實(shí)驗(yàn)hABMSCs接種在PT-SF雙層膜的粗糙面48 h后,掃描電鏡結(jié)果表明細(xì)胞可以較好的黏附在PT-SF雙層膜的粗糙面上 (圖3A、B)。CCK-8結(jié)果顯示,使用浸提液培養(yǎng) 1、4、7、14 d后,空白組、SF組和PT-SF組之間的吸光度值無(wú)明顯差異 (圖3C);活死細(xì)胞染色結(jié)果如圖3D顯所示,活細(xì)胞呈綠色熒光 (Live),死細(xì)胞呈紅色熒光 (Dead),空白組、SF組及PT-SF組粗糙面上活死細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。

圖3 PT-SF 膜的生物相容性

2.4 促成骨分化能力qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白組及SF組相比,PT-SF組的成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2 (P=0.056 5,F=10.38) 以及OSX 的表達(dá)顯著性增強(qiáng),其中ALP 與OSX的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 7,F=36.66;P=0.047 5,F=11.89)(圖4A-C)且成骨誘導(dǎo)至第7天 時(shí)ALP染色及第14天時(shí)茜素紅染色結(jié)果顯示,PT-SF組的ALP陽(yáng)性結(jié)果及茜素紅著色更加明顯(圖4D、E)。

圖4 PT-SF雙層膜的促成骨分化能力檢測(cè)

3 討論

臨床上使用的可吸收性GBR膜多由人工合成高分子材料或天然高分子材料制成,人工合成高分子材料制備的GBR膜在降解過(guò)程中可能會(huì)引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)不利于成骨[5],而天然高分子材料制備的膜則通常力學(xué)性能較差[6]。絲素蛋白是一種來(lái)源廣泛的天然高分子蛋白材料,具有優(yōu)異生物相容性和力學(xué)性能,同時(shí)其分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)成骨組織的主要有機(jī)成分I型膠原纖維具有高度的相似性,因此,在骨組織工程領(lǐng)域被公認(rèn)為頗具潛力的天然材料[7]。褐藻多酚是一種來(lái)源于褐藻的多酚類物質(zhì),既往研究[8]表明褐藻多酚具有抗氧化、抗菌等作用,同時(shí)也有研究[9-10]表明褐藻多酚具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方向分化的能力 。

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)溶液澆鑄、定向冷凍及冷凍干燥技術(shù)制備了由致密層和多孔層共同構(gòu)成的雙層絲素蛋白膜。其朝向軟組織面的致密層表面光滑結(jié)構(gòu)致密,致密的結(jié)構(gòu)可為SF雙層膜提供良好的力學(xué)性能,拉伸實(shí)驗(yàn)[11]結(jié)果表明其濕態(tài)下抗拉強(qiáng)度可達(dá) (3.293±0.122) MPa,顯著高于市售Bio-Gide 膠原膜的(1.68±0.54) MPa;朝向骨組織面的多孔層則具有粗糙表面,呈現(xiàn)出且與致密層的表面相垂直的“蜂窩”狀多孔結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞提供有效的附著位點(diǎn),對(duì)于骨缺損區(qū)域內(nèi)成骨相關(guān)細(xì)胞的黏附具有一定的促進(jìn)作用[12]。在此基礎(chǔ)上利用多酚類物質(zhì)易與蛋白質(zhì)通過(guò)氫鍵、疏水鍵及共價(jià)鍵發(fā)生反應(yīng)的特點(diǎn),在SF雙層膜的粗糙面上實(shí)現(xiàn)了褐藻多酚的負(fù)載[13]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞可以較好的與PT-SF雙層膜共存并能隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增殖。既往研究[9]表明,褐藻提取物可能通過(guò)激活Wnt和BMP通路上調(diào)成骨相關(guān)基因RUNX2、OSX以及ALP的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明,與空白組和SF組相比PT-SF組由于PT的加入,hABMSCs內(nèi)RUNX2與OSX的表達(dá)增強(qiáng), 同時(shí)ALP表達(dá)水平及活性也均高于空白組和SF組。以上結(jié)果表明PT-SF雙層膜具有良好的機(jī)械性能以及生物安全性,雙層膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)兼顧了屏障功能以及促進(jìn)細(xì)胞黏附的功能,同時(shí)結(jié)合在粗糙面上的PT彌補(bǔ)了SF雙層膜在促成骨能力上的缺陷。

綜上所述,該研究通過(guò)溶液澆鑄、定向冷凍及冷凍干燥技術(shù)構(gòu)建了PT-SF雙層膜。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所制備的PT-SF雙層膜有望作為新型的GBR 膜應(yīng)用于臨床。