王一茜，張少康，趙德安

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科,河南 衛(wèi)輝 453100;2.鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科,河南 鄭州 450004)

中性粒細胞起源于CD34+造血干細胞,是由骨髓發(fā)育而來的終末分化細胞,是人類血液循環(huán)中最豐富的白細胞,為先天免疫系統(tǒng)中的短命效應細胞。在血液循環(huán)中,中性粒細胞半衰期為 6～8 h,是機體抵御外來微生物的第一道防線。在感染早期,由感染部位釋放趨化因子產生趨化作用,吸引中性粒細胞從血流中快速遷移到感染組織,從而有效識別、結合和殺死微生物。吞噬、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、細胞脫顆粒和中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)在免疫調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[1]。2004年BRINKMANN等[2]用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和白細胞介素(interleukin,IL)-8對中性粒細胞進行刺激,發(fā)現(xiàn)中性粒細胞內染色質所形成的網(wǎng)狀結構可以捕獲細菌或病原體,并將這種含有DNA-蛋白質的網(wǎng)狀結構命名為NETs。NETs釋放細胞內容物并靶向捕獲病原體的過程是一種獨特的新的細胞程序性死亡方式,即網(wǎng)捕死亡(NETosis)[3-4]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、類風濕性關節(jié)炎(reumatoid arthritis,RA)、抗中性粒細胞胞質抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相關性血管炎(ANCA-associated vasculitis,AAV) 及川崎病(kawasaki disease,KD)等常見的自身免疫性疾病發(fā)病機制仍不十分明確,臨床治療效果欠佳,嚴重影響患者的生活質量。研究發(fā)現(xiàn),NETs可能在各種風濕免疫性疾病的免疫產生和發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用[5-6]。本文就NETs的形態(tài)學特點、作用機制及其在SLE、RA、AAV和KD等免疫性疾病發(fā)病過程中的作用研究進展進行綜述,以期為風濕免疫性相關疾病的診治和研究提供新方法及思路。

1 NETs形態(tài)學特點和作用機制

1.1 NETs的觸發(fā)要素及形態(tài)學特征

各種興奮劑在體內外均觸發(fā)生成NETs,其中以包括PMA、IL-8在內的細胞因子、脂多糖、活化血小板、真核生物、原核生物、補體、自身抗體、尿酸鹽晶體、過氧化氫等最為常見[7-9]。由中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、組織蛋白酶G、蛋白酶3(proteinase 3,PR3)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、乳鐵蛋白、明膠酶、溶菌酶C、鈣衛(wèi)蛋白等共同組成的組蛋白、顆粒酶和肽是NETs的主要成分[10]。當機體中NETs生成過多或無法及時清除時,其通過釋放多種活性分子來加速炎癥過程,從而導致免疫反應的發(fā)生。因此,在許多疾病的炎癥反應、自身免疫和其他病理過程中,NETs的生成是把雙刃劍,起著關鍵作用[11]。目前,NETs主要分為3種方式:中性粒細胞裂解后所形成的NETs(自殺式NETs)、活細胞通過囊泡釋放NETs(存活式NETs)及中性粒細胞在存活狀態(tài)下釋放由線粒體DNA組成的NETs(線粒體式NETs)。

NETs由低級、次級和高級中性粒細胞顆粒組成,也包括高度去濃縮染色質纖維及瓜氨酸化組蛋白等。通過電子顯微鏡可觀察到,在NETs的DNA骨架上存在由組蛋白、顆粒和細胞質蛋白共同組成的直徑約為25 nm的球形復合物結構域,其嵌入以脫氧核糖核酸為主要組成部分的直徑為15～17 nm的光滑纖維中,并儲存于特定中性粒細胞顆粒中,從而提供抗菌性能[12]。THIAMA等[13]研究發(fā)現(xiàn),中性粒細胞受到刺激后,其肌動蛋白細胞骨架會快速分解,使質膜微泡脫落,波形蛋白及微管細胞骨架重塑,內質網(wǎng)囊泡形成,染色質解凝和核分葉性消失,細胞核膜、細胞質膜通透性發(fā)生變化,最終導致細胞質膜破裂,細胞游離DNA(cell free DNA,cfDNA)被排出細胞外。

1.2 NETs形成的經(jīng)典途徑

NETs形成的經(jīng)典途徑由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶產生ROS過程介導。PMA可誘導鈣二?；视皖愃莆飶膬荣|網(wǎng)進入細胞質中,使蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性增強,gp91phox/Nox2通路磷酸化,從而使鈣離子釋放,激活Raf-絲裂原活化蛋白激酶激酶-胞外調節(jié)蛋白激酶途徑,促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶組裝,而吞噬體膜組裝由NADPH氧化酶組成的多聚體復合物,進一步誘導ROS分泌,從而激活下游信號通路[14]。NADPH氧化酶及ROS的產生與NETs的形成密不可分。在這個過程中,NADPH氧化酶促使ROS產生是最為關鍵的步驟,因此也被稱為依賴 NADPH的NETosis。

1.3 NETs形成的非經(jīng)典途徑

NETs的非經(jīng)典途徑,即非依賴性NETs形成,是通過線粒體活性氧產生和Ca2+內流介導[15]。線粒體作為提供糖酵解支持的細胞器,在中性粒細胞中含量相對較低;最初認為線粒體不參與NETs發(fā)生,隨著進一步研究發(fā)現(xiàn),線粒體在病原體反應信號傳遞過程中起關鍵作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn),在內質網(wǎng)中,被動員的Ca2+濃度在細胞質中明顯增加,在線粒體基質中迅速積累并達到膜電位,從而激活非特異性線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),增加線粒體ROS的產生。同時上述這種氧化應激作用又促進mPTP的開放,使Ca2+內流增加,肽?；彼崦搧啺访?被活化,進而使中性粒細胞染色質伸展、解凝聚到細胞外而發(fā)揮免疫功能[17-19]。

2 NETs在風濕免疫性疾病中的作用

風濕免疫性疾病最為突出的特征就是炎癥反應影響到關節(jié)、組織和內臟器官。當自身免疫力下降時,機體產生各種抗體并作用于自身細胞分子,使免疫功能紊亂,引發(fā)一系列炎癥反應,從而導致組織和器官被破壞。這類疾病的病因及發(fā)病機制大多不明,中性粒細胞及NETs在該類疾病發(fā)病中可能起一定作用。

2.1 NETs與SLE

SLE為適應性免疫介導的自身免疫性疾病,多發(fā)于青年女性。SLE通常累及皮膚和關節(jié),也可影響機體多個系統(tǒng),甚至危及生命。SLE主要特征是生成抗雙鏈DNA、抗核抗體等多種自身抗體及消耗自身補體。SLE是一種多基因疾病,其發(fā)病機制較為復雜,與遺傳和環(huán)境因素有關,可導致嚴重適應性免疫功能異常。SLE患者機體內中性粒細胞凋亡增強可導致NETs的釋放負荷增強,由此推測NETs可能參與SLE疾病的發(fā)展過程。有研究發(fā)現(xiàn),脫氧核糖核酸酶-1降解酶的活性降低導致降解NETs能力下降,這使患者更容易患狼瘡性腎炎,由此推斷出NETs在SLE發(fā)病機制中起著不可或缺的作用[20]。有研究證實,SLE的發(fā)生與細胞死亡方式及過多NETs的有效清除有著密切聯(lián)系[21-22]。過多的NETs可導致SLE患者中cfDNA增多,從而激活自身免疫系統(tǒng),釋放過量的抗核抗原(如DNA和組蛋白等自身抗體)[23],在炎癥反應環(huán)境中,當機體中凋亡細胞未被及時清除而失去細胞膜完整性時,會出現(xiàn)自身抗原分子,誘發(fā)自身免疫反應,導致全身各個系統(tǒng)受累,這是狼瘡性腎炎導致SLE患者死亡的最主要原因。蔣秋梅等[24]和張克恭等[25]研究發(fā)現(xiàn),狼瘡性腎炎患者不僅NETs水平明顯升高,MPO、NE水平也明顯升高;同時也證實,SLE的活動程度與NETs的形成增多相關,即NETs水平越高,SLE活動性越強,狼瘡性腎炎越易發(fā)生,預后越差。

低密度粒細胞(low-density granulocytes,LDGs)最初是在SLE患者外周血單個核細胞中分離的促炎中性粒細胞亞群。SLE患者的LDGs水平明顯增加,而LDGs不僅促使炎癥細胞分泌IL-6、IL-8能力增強,使細胞吞噬能力受損,還可以刺激T淋巴細胞產生腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等因子調控基因及蛋白合成,從而誘導產生更多的NETs,導致內皮細胞受損,引發(fā)一系列自身免疫反應[24-26]。有學者在轉錄分析及蛋白質調控2個方面均證實,LDGs作為中性粒細胞亞群促進了NETs生成,并導致小血管損傷,從而導致狼瘡性肺炎及狼瘡性腎炎的發(fā)生[27]。綜上可知,NETs既參與了SLE的發(fā)病過程,又在狼瘡性腎炎發(fā)病中起了關鍵作用。NETs在心肌梗死、中風、心肌病、間歇性跛行及腎炎等發(fā)病過程中,除了通過導致內皮損傷途徑外,是否存在其他損害途徑需進一步研究。此外,弄清楚NETs的哪些組分具有關鍵核心作用,需要進一步進行分層研究,以便為臨床治療提供精確的干預靶點。

2.2 NETs與RA

RA是滑膜關節(jié)的慢性自身炎癥性疾病,最主要的臨床表現(xiàn)包括關節(jié)腫脹和疼痛,其最終可導致關節(jié)畸形和功能喪失。在RA滑膜中,淋巴組織B細胞產生單克隆抗體,其中一部分抗體對瓜氨酸化組蛋白H2A/H2B表現(xiàn)出強烈反應,經(jīng)抗瓜氨酸化-H2A/H2B活性抗體選擇性識別的中性粒細胞將會產生大量NETs。RA患者的中性粒細胞更易被刺激而產生NETosis,且表達一些與類風濕性關節(jié)炎相關的自身抗體,比如類風濕因子和瓜氨酸化蛋白等[28];此外,NETs作為瓜氨酸化自身抗原的來源,同時能激活損傷關節(jié)的關鍵細胞RA滑膜成纖維細胞,并參與RA關節(jié)損傷的發(fā)生[29]。cfDNA作為NETs的主要成分,可與體內特定的蛋白結合,形成免疫復合物并激活下游通路,產生大量細胞因子,現(xiàn)已作為檢測某些免疫性疾病治療效果及預測預后的指標。SPENGLER 等[29]通過檢測關節(jié)腔積液中的cfDNA發(fā)現(xiàn),具有活性的PAD同工酶被死亡的中性粒細胞釋放到關節(jié)腔中,使精氨酸殘基脫亞氨基形成瓜氨酸化蛋白,這將導致釋放更多的NETs,進而增加自身抗原產生,使機體免疫功能受損。也有學者提出了相反的結論,認為cfDNA雖然可以作為RA生物學標志物,但RA患者血清中cfDNA水平顯著低于健康人群。有研究發(fā)現(xiàn),RA患者cfDNA較健康人群高30多倍,這提示cfDNA對RA有重要作用[30]。綜上所述, RA的發(fā)生與NETs有著密切聯(lián)系。

RA患者血液中活化的中性粒細胞異常表達增加,并導致細胞因子被活化、產生ROS,從而延遲細胞凋亡。BACH等[31]采用橫斷面研究的方法發(fā)現(xiàn),RA患者滑膜液中存在大量中性粒細胞,其被驅動因子激活后,使大量NETs被組蛋白瓜氨酸化后得到釋放,從而黏附病原體,破壞關節(jié)滑膜,這證明活化的中性粒細胞通過產生大量的NETs來破壞關節(jié)滑膜,參與RA的發(fā)病。目前,RA的實驗室診斷主要依賴類風濕因子(rheumatoid factor,RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,ACPA)檢測,已證實APCA滴度與RA的嚴重程度有關。NETs的形成水平影響著RA的發(fā)病與進展,因此,其形成水平或者其中某些成分是否可以作為新型標志物用于RA的診斷或者預測疾病嚴重程度,仍需要更多的證據(jù)。RA主要治療措施是利用抗風濕性藥物緩解病情,但是,盡管有些患者可能在發(fā)病初期就接受了規(guī)范的治療,疾病仍有可能會進一步進展,導致患者相關部位功能障礙。有學者發(fā)現(xiàn),雷公藤可顯著抑制NETs的形成、嗜中性粒細胞的氧爆發(fā)及NETs形成[32]。因此,研發(fā)能夠抑制NETs形成或者加速NETs清除從而達到緩解和治療RA的藥物,也是今后的研究方向和重點之一。

2.3 NETs與AAV

AAV是一種以小血管炎為特征的自身免疫性疾病,肺出血及腎小球腎炎是其主要的臨床表現(xiàn);包括顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性血管炎及嗜酸性肉芽腫性血管炎[33]。AAV患者血清中MPO/ PR3-ANCA呈陽性表達,其中MPO-ANCA致病性很強,與疾病的活動程度有關。DAVIES等[34]在1982年首次發(fā)現(xiàn)ANCA,并認為AAV是一種ANCA 相關的血管炎。KRAAIJ等[9]將99例AAV患者NETs的形成水平與健康個體進行比較發(fā)現(xiàn),ANCA患者NETs的形成明顯增多,增多的NETs同時又導致ANCA自身抗原的產生,從而導致惡性循環(huán);以上這種情況在疾病活動期表現(xiàn)更為顯著,由此證明,NETs可能是AAV的獨立危險因素之一。

研究認為,NETs自身抗原的來源是MPO和PR3[35];也有研究認為,NETs產生的起始信號是ANCA,即中性粒細胞被ANCA過度激活并釋放出ROS、NETs等,同時隨著細胞因子釋放的增加,導致免疫損傷進一步加重[36]。KESSENBROCK等[36]和SU等[37]研究發(fā)現(xiàn),MPO-ANCA與MPO在中性粒細胞上相結合,使位于Fc區(qū)與Fcγ的受體發(fā)生相互作用,誘導產生ROS和激活肽?；彼崦搧啺访?,促使NETs形成。這更加說明,被過度激活的中性粒細胞可導致細胞因子異常產生,使ROS釋放增多,促進NETs釋放,同時過多的NETs又作為自身抗原再次加劇自身免疫反應,對全身小血管造成損害,使病情進一步惡化[38]。組蛋白H3被認為是 NETs特異性標志物,可使帶正電荷的精氨酸殘基瓜氨酸化,使離子之間作用消失,染色質解離,這是形成NETosis的第一步[39]。研究發(fā)現(xiàn),在AAV中,組蛋白H3是識別活化中性粒細胞的重要工具之一,其不僅是疾病的特異性標志,同樣也是疾病活動的潛在標志[6,40]。DNA酶Ⅰ具有核酸內切酶活性,除了可以降解外源 DNA外,還在降解凋亡細胞和壞死細胞的染色質等方面起到較大作用,且對NETs形成具有負向調節(jié)作用。已證實,ANCA-IgG可誘導NETs生成,且血清中 DNA酶Ⅰ活性降低以及抗NETs抗體均可導致NETs形成[41]。綜上所述,NETs過度增多或NETs降解能力下降可使NETs增加,進而導致AAV的發(fā)生發(fā)展。

2.4 NETs與KD

KD是兒童時期繼發(fā)冠狀動脈疾病的重要原因之一。免疫激活是KD急性期的顯著特征[42]。KD的具體病因可能與先天免疫失調密切相關,但其確切機制仍未明確。NETs對血管內皮細胞有直接細胞毒作用,可能參與KD的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn),急性期KD患者的NETs、cfDNA及NE水平均高于恢復期KD患者及健康對照組,提示NETs可能參與了KD的發(fā)生發(fā)展[43]。在此基礎上,有學者通過外源性NETs刺激中性粒細胞證實,KD患者中性粒細胞更易被激發(fā)。在NETs刺激下,血管內皮生長因子A和缺氧誘導因子-1α的表達增加,激活磷酸肌醇激酶3主導的磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路,從而導致血管損傷,引起全身中小血管病變,甚至累及冠狀動脈,這可能是KD血管炎發(fā)生的病理機制之一[44]。綜上所述,NETs與KD發(fā)病密切相關。

3 結論

參與機體免疫應答的中性粒細胞受到感染或損傷時,可發(fā)揮宿主早期的防御作用。活化的中性粒細胞胞膜脫出核和顆粒成分形成NETs,這種殺菌網(wǎng)絡在細胞外捕獲和殺死細菌的同時,也會導致易感個體自我耐受和產生自身免疫反應。但NETs在風濕免疫性疾病中精確的信號通路仍需要進一步明確;同樣,NETs在IgA血管炎等免疫系統(tǒng)疾病中的相關研究甚少,因此,需要更多的研究探索NETs在免疫系統(tǒng)疾病中的作用。