張 玲，王 亞，徐 飛，楊亦舒，韓克陽，王韶瀾，劉 源，楊 林，安 珍，李 娟，吳 輝，宋 杰，吳衛(wèi)東

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.鎮(zhèn)江市高等?？茖W(xué)校衛(wèi)生護(hù)理學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212028)

目前,空氣污染仍然是全球突出的環(huán)境和公共衛(wèi)生問題,其不僅會(huì)導(dǎo)致呼吸和心血管系統(tǒng)疾病,還會(huì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不利影響,如增加神經(jīng)退行性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。柴油機(jī)排放顆粒物(diesel exhaust particle,DEP)是交通污染顆粒物的主要成分,也是城市PM2.5的主要來源[2]。DEP可以穿過血腦屏障到達(dá)大腦,造成神經(jīng)毒性效應(yīng)[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞,發(fā)揮著免疫監(jiān)視功能,其分泌的炎癥細(xì)胞因子可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥,與神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)[4]。研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞可能在顆粒物引起的中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著重要作用[5-7]。為闡明大氣污染顆粒物所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性效應(yīng)及其機(jī)制,本研究用DEP處理大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2,以期探討DEP對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響以及氧化應(yīng)激在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑與儀器

新生24 h內(nèi)清潔級Sprague Dawley(SD)大鼠6只由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; 胎牛血清購自美國 Gibco公司,小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司,達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購自北京索萊寶生物科技有限公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自美國Abmole公司,乳酸脫氫酶、活性氧(reactive oxygen species,ROS) 檢測試劑盒、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,β-actin、離子鈣結(jié)合適配分子1(ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1)抗體購自美國Affinity公司,引物由上海生工生物工程有限公司合成,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司,DEP由美國北卡羅來納大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)中心饋贈(zèng);酶標(biāo)儀購自日本Enspire 公司,流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀購自瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離

參考文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離。將6只新生大鼠放入4 ℃乙醇中浸泡麻醉,然后用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡消毒,無菌條件下開顱,快速取腦,置于預(yù)冷Hanks緩沖液中,在組織顯微鏡下仔細(xì)剔除腦膜和血管;迅速移入含25 g·L-1胰蛋白酶的離心管中,用巴氏吸管多次吹打腦組織至勻漿狀,37 ℃水浴鍋中消化20 min,加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化;細(xì)胞篩過濾后,4 ℃下250×g離心 5 min,之后將離心沉淀的細(xì)胞吹打制成單細(xì)胞懸液,接種于提前包被好Matrigel的T75培養(yǎng)瓶中,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 d,拍打法收集小膠質(zhì)細(xì)胞,用 CD11b 抗體標(biāo)記收集到的細(xì)胞并于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞按1×108L-1分別接種于 T25培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)瓶中加入含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的DMEM,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí),用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 CCK-8法檢測大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞的細(xì)胞活力

收集用胰蛋白酶消化后的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液,以每孔(1.0～1.5)×108L-1接種于96孔板中,每孔100 μL。將細(xì)胞分為空白組、對照組和染毒組。將96孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,空白組細(xì)胞加入用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋的CCK-8試劑;對照組細(xì)胞加入未經(jīng)DEP刺激(0.0 mg·L-1DEP)的細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8試劑;染毒組細(xì)胞分別用12.5、25.0、50.0 mg·L-1DEP懸液染毒24 h,每孔再加入10 μL CCK-8試劑溫育1 h;然后用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處各孔的吸光度(absorbance,A)值。細(xì)胞活力=(染毒組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,取均值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞中ROS水平

將原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中,37 ℃ 培養(yǎng)36 h后加入ROS探針(按1：1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋2,7-二氯熒光素二乙酸酯,終濃度為10 μmol·L-1),繼續(xù)培養(yǎng)45 min,然后分別向孔內(nèi)加入0.0、12.5、25.0、50.0 mg·L-1DEP懸液染毒6 h。用25 g·L-1胰蛋白酶200 μL消化細(xì)胞,加入500 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)終止消化,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清并加入500 μL PBS重懸后立即上流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI),以MFI值代表ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.5 Western blot檢測染毒后BV2細(xì)胞中Iba-1蛋白表達(dá)水平

將染毒后的BV2細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板。用放射免疫沉淀裂解液裂解BV2細(xì)胞,每孔加入裂解液400 μL于冰上裂解30 min,然后12 000 r·min-1離心15 min,取上清,用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量,加入5×loading后100 ℃煮蛋白10 min。按照說明書提前配制好分離膠和濃縮膠,膠凝固后進(jìn)行蛋白上樣,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、體積分?jǐn)?shù)為5%脫脂牛奶封閉、一抗4 ℃ 過夜、洗膜、二抗孵育和洗膜后,上機(jī)顯影,觀察條帶變化。并用Image J軟件分析條帶灰度值,以Iba1蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為Iba1蛋白相對表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.6 qRT-PCR法檢測BV2細(xì)胞中TNF-α和IL-10 mRNA 表達(dá)水平

采用TRIzol裂解法提取BV2細(xì)胞內(nèi)總RNA,測定RNA在230、260、280 nm處的A值,計(jì)算其濃度和純度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。β-actin上游引物序列為5′-AGGCGACAGCAGTTGGTTGGA-3′,下游引物序列為5′-TTGGGAGGGTGAGGGACTTCCT-3′;TNF-α上游引物序列為5′-CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3′,下游引物序列為5′-GTGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTG-3′;IL-10上游引物序列為5′-TGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCC-3′,下游引物序列為5′-AGCCGCATCCTGAGGGTCTTC-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系20.0 μL,2×Universal SYBR qPCR Mix 10.0 μL,上下游引物各 0.2 μL,DNA模板1.0 μL,加水補(bǔ)齊20.0 μL。 反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 1 s。以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α、IL-10 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α蛋白表達(dá)水平

將大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞按每孔(1～2)×105個(gè)接種于12孔培養(yǎng)板中,于37 ℃培養(yǎng)箱中溫育36 h后,分別加入0.0、12.5、25.0、50.0 mg·L-1的DEP懸液染毒24 h。將培養(yǎng)液收集到EP管中,4 ℃,3 000 r·min-1離心15 min,取上清,采用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.8 抗氧化劑NAC干預(yù)后大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞中ROS水平檢測

將大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞按每孔1×105個(gè)接種于12孔板中,培養(yǎng)36 h后,吸出培養(yǎng)液,將12孔板平均分為對照組、DEP染毒組、NAC處理組、NAC+DEP組。對照組和DEP染毒組細(xì)胞用DMEM培養(yǎng),NAC處理組和NAC+DEP組細(xì)胞給予5 mmol·L-1NAC預(yù)處理2～4 h;之后加入ROS探針(按1：1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯,終濃度為10 μmol·L-1),溫育45 min;對照組和NAC處理組加入DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),DEP染毒組和NAC+DEP組加入DEP懸液(DEP終濃度為50 mg·L-1)染毒6 h。按“1.2.4”項(xiàng)中的方法上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞MFI。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.9 抗氧化劑NAC干預(yù)后BV2細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-10 mRNA表達(dá)水平檢測

將BV2細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于12孔板中,培養(yǎng)36 h后,將培養(yǎng)液上清吸出,將12孔板平均分為對照組、DEP染毒組、NAC處理組、NAC+DEP組。對照組和DEP染毒組細(xì)胞用DMEM培養(yǎng),NAC處理組和NAC+DEP組細(xì)胞給予5 mmol·L-1NAC預(yù)處理2～4 h;然后對照組和NAC處理組加入DMEM繼續(xù)培養(yǎng),DEP染毒組和NAC+DEP組加入DEP懸液(DEP終濃度為50 mg·L-1)染毒12 h。收集細(xì)胞,用TRIzol裂解法提取mRNA,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用qRT-PCR 法檢測細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-10 mRNA表達(dá)水平,方法同“1.2.6”項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次,取均值。

1.2.10 抗氧化劑NAC干預(yù)后大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)檢測

將大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔(1～2)×105個(gè)接種于12孔板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后,吸出培養(yǎng)液上清,將12孔板平均分為對照組、DEP染毒組、NAC處理組、NAC+DEP組。對照組和DEP染毒組細(xì)胞用DMEM培養(yǎng),NAC處理組和NAC+DEP組細(xì)胞給予5 mmol·L-1NAC預(yù)處理2～4 h;對照組和NAC處理組加入DMEM繼續(xù)培養(yǎng),DEP染毒組和NAC+DEP組加入DEP懸液(DEP終濃度為50 mg·L-1)染毒24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000 r·min-1離心15 min,取上清,采用ELISA法檢測上清液中TNF-α蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DEP對小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

12.5、25.0、50.0 mg·L-1染毒組原代小膠質(zhì)細(xì)胞的活力顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。50.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞的活力顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12.5、25.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞的活力與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度DEP組小膠質(zhì)細(xì)胞活力的比較Tab.1 Comparison of cell activity of microglia among different concentration of DEP group

2.2 不同濃度DEP對小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS的影響

12.5、25.0、50.0 mg·L-1染毒組原代小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。25.0、50.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞中ROS水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12.5 mg·L-1染毒組與對照組BV2細(xì)胞中ROS水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度DEP組小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS水平比較Tab.2 Comparison of ROS level in microglia among different concentration of DEP group

2.3 不同濃度DEP對BV2細(xì)胞中Iba1蛋白表達(dá)的影響

12.5、25.0、50.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞中Iba1蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著DEP濃度的增加,Iba-1蛋白表達(dá)呈升高趨勢。結(jié)果見圖1和表3。

圖1 不同濃度DEP組BV2細(xì)胞中Iba-1蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression level of Iba1 protein in BV2 cells in different concentration of DEP group

表3 不同濃度DEP組BV2細(xì)胞中Iba1蛋白相對表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of relative expression of Iba1 protein in BV2 cells among different concentration of DEP group

2.4 不同濃度DEP組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較

12.5、25.0、50.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞中TNF-α mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);50.0 mg·L-1染毒組BV2細(xì)胞中IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 12.5、25.0 mg·L-1染毒組與對照組BV2細(xì)胞中IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 不同濃度DEP組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of relative expression of TNF-α and IL-10 mRNA in BV2 cells among different concentration of DEP group

2.5 不同濃度DEP對大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)的影響

12.5、25.0、50.0 mg·L-1染毒組大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表5 不同濃度DEP組對大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較Tab.5 Comparison of expression level of TNF-α protein in primary microglia of rats among different concentration of DEP group

2.6 NAC對DEP暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

DEP染毒組原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞中ROS水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NAC處理組原代小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NAC處理組與對照組BV2細(xì)胞中ROS水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NAC+DEP組原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞中ROS水平顯著低于DEP染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表6。

表6 不同NAC預(yù)處理組小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS水平的比較Tab.6 Comparison of ROS levels in microglia among different NAC pretreated group

2.7 NAC對DEP暴露后BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10 mRNA相對表達(dá)量的影響

DEP染毒組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NAC處理組與對照組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NAC+DEP組BV2細(xì)胞中TNF-α mRNA相對表達(dá)量顯著低于DEP染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NAC+DEP組 與DEP染毒組BV2細(xì)胞中IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表7。

表7 不同NAC預(yù)處理組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-10mRNA相對表達(dá)量比較Tab.7 Comparison of relative expression of TNF-α and IL-10 mRNA in BV2 cells among different NAC pretreated group

2.8 NAC對DEP暴露后大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)的影響

DEP染毒組原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NAC處理組與對照組原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);NAC+DEP組原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著低于DEP染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表8。

表8 不同NAC預(yù)處理組大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)水平比較Tab.8 Comparison of the expression of TNF-α protein in primary microglia of rats among different NAC pretreatment group

3 討論

空氣污染物是一種復(fù)雜的化學(xué)混合物,來源廣泛,包括發(fā)動(dòng)機(jī)排放、煤炭燃燒、生物質(zhì)燃燒、火山噴發(fā)和二次光化學(xué)產(chǎn)物[9]。有研究表明,空氣污染與慢性呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和代謝障礙的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。COSTA等[12]研究發(fā)現(xiàn),空氣污染還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。DEP是主要的城區(qū)污染物,DEP染毒濃度根據(jù)已有研究確定[13],本研究采用DEP染毒大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞,探討DEP對2種細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響及其潛在機(jī)制。

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦實(shí)質(zhì)的髓系細(xì)胞,具有免疫前哨細(xì)胞的功能,是疾病發(fā)生時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥介質(zhì)的主要來源[4,14],其炎癥反應(yīng)是包括阿爾茲海默病在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病的核心機(jī)制[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞可在體內(nèi)多種因素(如Aβ和促炎細(xì)胞因子)的刺激下被激活[16],也可以被環(huán)境污染物激活,如柴油尾氣顆粒物[17]等。Iba-1表達(dá)增加是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志,本研究結(jié)果證實(shí),DEP染毒后BV2細(xì)胞中Iba-1的表達(dá)升高,且呈劑量依賴性,說明小膠質(zhì)細(xì)胞可以被DEP激活。有研究發(fā)現(xiàn),暴露于DEP后,小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS有所升高[18],而小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中ROS的主要來源,這就將空氣污染與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病聯(lián)系起來。

空氣污染會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激,有研究報(bào)道,大鼠吸入DEP 1個(gè)月后可使其額葉皮層中促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)增加,進(jìn)一步證明DEP暴露可引發(fā)神經(jīng)炎癥[19]。有研究顯示,呼吸道灌注DEP可增加大鼠腦組織中TNF-α的表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示, DEP暴露可使小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α表達(dá)增加,即小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

為探討氧化應(yīng)激是否在炎癥因子表達(dá)中發(fā)揮作用,本研究采用抗氧化劑NAC預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NAC可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞因染毒DEP而導(dǎo)致的炎癥因子TNF-α mRNA和蛋白的升高,說明氧化應(yīng)激在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。TNF-α的產(chǎn)生部分依賴于核因子-κb(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,ROS與NF-κB信號通路有多種相互作用,NF-κB依賴基因的轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平,反過來,NF-κB活性水平也受ROS水平的調(diào)節(jié),ROS能夠以多種方式在多個(gè)位置同時(shí)發(fā)揮作用調(diào)節(jié)NF-κB通路[20],這可能是氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的機(jī)制之一。DEP所致IL-10的升高并不受氧化應(yīng)激抑制劑NAC的影響,說明IL-10的產(chǎn)生過程可能不受氧化應(yīng)激的影響,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

DEP暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激以及炎癥因子表達(dá)增加,氧化應(yīng)激在DEP誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步闡明顆粒污染物的神經(jīng)毒性作用及其機(jī)制,制定干預(yù)空氣污染誘發(fā)神經(jīng)退行性變的有效措施提供重要依據(jù)。