王翰 鄧啟民 曾永龍

成都云克藥業(yè)有限責任公司藥物研發(fā)部，成都 610225

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumor，NET）是一類起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化并表達神經(jīng)內(nèi)分泌標志物的少見腫瘤，可發(fā)生于全身各處，以肺、胃、腸、胰腺NET 最常見[1]。近幾十年來，各國流行病學調(diào)查結(jié)果顯示NEM 的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[2-3]。放射性核素肽受體介導治療（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）是通過放射性核素標記的生長抑素類似物與NET 細胞表面過表達的生長抑素受體（somatostatin receptors，SSTR）結(jié)合，將放射性藥物帶至腫瘤細胞，利用藥物放射性達到殺滅腫瘤細胞的目的[4]。近些年，在一些單中心的臨床研究中，PRRT 表現(xiàn)出了較好的治療效果和較高的安全性，被認為是不可切除或轉(zhuǎn)移性NET 的一種可選擇的治療方法，受到越來越多的關注[5]。目前，在PRRT 中使用最多和最廣的放射性核素為177Lu，但對體積較大的腫瘤來說，其治療效果不如90Y[6]。在PRRT 的相關藥物中，以90Y 和177Lu 標記的生長抑素類似物1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸-酪氨酸3-奧曲肽（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-Tyr（3）-octreotide，DOTATOC）和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸-D-苯丙氨酸1-酪氨酸3-蘇氨酸8-奧曲肽（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-Tyr（3）-octreotate，DOTATATE）的研究最為廣泛。其中177Lu-DOTATATE 分別于2017 年和2018 年被歐洲和美國批準上市[7]。90Y-DOTATOC 也正式被用于開展臨床研究[8-10]。目前對于90Y-DOTATOC 的藥理學評價主要集中在其對不同類型SSTR 的親和性及其在動物體內(nèi)分布的研究上[11-12]。90Y-DOTATOC對NET 細胞增殖抑制作用的研究較少。本研究通過采用90Y 標記DOTATOC 后，探討DOTATOC 和90Y-DOTATOC 對人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤BON-1（SSTR+）細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與和儀器

DOTATOC 購自上海強耀生物科技有限公司；90YCl3（無載體）購自成都云克藥業(yè)有限責任公司；DB1-100 干式恒溫器購自上海泰坦科技股份有限公司；Tri-Carb 2810 TR 液閃計數(shù)儀購自美國PerkinElmer 公司；UC-2 超聲波清洗器購自上海泰坦科技股份有限公司；SpectraMax Plus 酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；ITLC-SG 色譜紙購自美國Agilent Technologies 公司；SPE-PAK C18 分離小柱（WAT023501）購自美國Waters 公司；BON-1細胞株購自上海中亞生物研究所。人胰腺膽管瘤PANC-1（SSTR?）細胞株購自美國ATCC 公司。

1.2 實驗方法

1.2.190Y 標記DOTATOC

取20 μg DOTATOC 分裝于5 ml EP（eppendorf）管中，向EP 管中加入2 ml PBS，超聲波混勻。然后再向EP 管中加入37 MBq90Y，震蕩混勻。將EP 管放入干式恒溫器中，90℃反應30 min。反應結(jié)束后取出，冷卻約5 min。將EP 管中的反應液移入西林瓶中，采用純化水稀釋至約4 ml。取樣，采用紙層析法測定標記率。

1.2.290Y-DOTATOC 純化

用無菌注射器分別吸取5 ml 70%乙醇和5 ml生理鹽水，將注射器前面接頭與C18 分離小柱上面連接，緩慢推送注射器，將液體注入廢液瓶中。采用同樣方法，用無菌注射器分別吸取反應液和2 ml 生理鹽水，與C18 分離小柱連接后，將液體推送注入廢液瓶中。再次采用同樣方法，將無菌注射器分別吸取1 ml 60%乙醇和3 ml 生理鹽水，與C18 分離小柱連接后，將液體推送注入產(chǎn)品瓶中，最終得到約4 ml 產(chǎn)品溶液。取樣，采用紙層析法測定放射化學純度，采用液閃計數(shù)儀測定放射性比活度。

1.2.390Y-DOTATOC 的穩(wěn)定性考察

90Y-DOTATOC 在生理鹽水中的穩(wěn)定性考察：取950 μl 生理鹽水加入到 2 ml EP 管中，加入純化后的90Y-DOTATOC 溶液50 μl。在生理鹽水中室溫保存（20℃），每天測1 次放射化學純度，直至第7 天。

90Y-DOTATOC 在10%胎牛血清中的穩(wěn)定性考察：取850 μl PBS 緩沖液加入到2 ml EP 管中，加入100 μl 胎牛血清，再加入純化后的90Y-DOTATOC 50 μl。水浴37℃保存，每天測1 次放射化學純度，直至第7 天。

1.2.490Y-DOTATOC 對BON-1 細胞的抑制作用

采用DMEM 或RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)BON-1 和PANC-1 細胞，在37℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。采用MTT 法[13]檢測腫瘤細胞的存活率，按照每孔100 μl 含約6 000 個細胞接種于96 孔板。設立陰性對照組、陽性對照組（長春新堿，50 μmol/L）、DOTATOC 組（25 μmol/L）、90Y 組（1.8 MBq/ml）、90Y-DOTATOC 高劑量組（90Y 的放射性濃度為1.8 MBq/ml，DOTATOC 的濃度為25 μmol/L）、90Y-DOTATOC 中劑量組（90Y 的放射性濃度為0.37 MBq/ml，DOTATOC 的濃度為25 μmol/L）、90Y-DOTATOC 低劑量組（90Y 的放射性濃度為0.074 MBq/ml，DOTATOC 的濃度為25 μmol/L）。每孔加入含有各實驗組中藥物的培養(yǎng)基100 μl，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 和48 h 后，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以移液槍吸去上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，室溫置于搖床10 min，于酶標儀490 nm處測定光密度OD 值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1?OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示。組間對照比較采用獨立樣本t檢驗（方差齊）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 90Y 標記DOTATOC 的結(jié)果

90Y 標記DOTATOC 的標記率為（61.93±3.53）%。純化后90Y-DOTATOC 的放射化學純度為（98.88±0.38）%，放射性濃度為4.6 MBq/ml，比活度約為1.6 GBq/μmol。

2.2 90Y-DOTATOC 穩(wěn)定性考察

從表1 可知，隨著時間的推移，90Y-DOTATOC在生理鹽水和10%胎牛血清中的放射化學純度降低速度非常緩慢，7 d 后，在生理鹽水和10%胎牛血清中的放射化學純度仍達97.33%和97.02%。

表1 90Y-DOTATOC 在生理鹽水和10%胎牛血清中的穩(wěn)定性考察結(jié)果（%）Table 1 Stability test results of 90Y-DOTATOC in physiological saline and 10% bovine serum (%)

2.3 90Y-DOTATOC 對BON-1 細胞的抑制作用

從表2 可知，加藥24 h 后，與陰性對照組相比，DOTATOC 組和90Y-DOTATOC 高、中、低劑量組對BON-1 細胞的抑制作用顯著增強，且差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.654～5.399，均P<0.05）；與陰性對照組比較，90Y-DOTATOC 高、中、低劑量組對PANC-1 細胞的抑制作用顯著增強，且差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.993～3.984，均P<0.05）；與90Y 組比較，90Y-DOTATOC 高劑量組對BON-1 和PANC-1 細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=2.698、2.973，P=0.031、0.048）；與DOTATOC 組相比，90Y-DOTATOC 高、中劑量組對BON-1 和PANC-1 細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=2.267～3.772，均P<0.05）。加藥48 h 后，與陰性對照組相比，90YDOTATOC 高劑量組、中、低劑量組、DOTATOC組、90Y 組對BON-1 細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=2.594～6.155，均P<0.05）；與陰性對照組相比，90Y-DOTATOC 高、中、低劑量組和90Y 組對PANC-1細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=2.110～5.783，均P<0.05）；與90Y 組相比，90Y-DOTATOC 高劑量組對BON-1和PANC-1 細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=3.180、2.728，P=0.042、0.031）；與DOTATOC組相比，90Y-DOTATOC 高、中劑量組對BON-1 和PANC-1 細胞的抑制作用均顯著增強，且差異有統(tǒng)計學意義（t=2.615～3.852，均P<0.05）。

表2 90Y-DOTATOC、DOTATOC、90Y 對BON-1 和PANC-1 腫瘤細胞的抑制作用[（±s），%]Table 2 Results of inhibitory effects of 90Y-DOTATOC, DOTATOC, and 90Y on BON-1 and PANC-1 tumor cells [(±s), %]

表2 90Y-DOTATOC、DOTATOC、90Y 對BON-1 和PANC-1 腫瘤細胞的抑制作用[（±s），%]Table 2 Results of inhibitory effects of 90Y-DOTATOC, DOTATOC, and 90Y on BON-1 and PANC-1 tumor cells [(±s), %]

注：DOTATOC 為1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸-酪氨酸3-奧曲肽；BON-1 為人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細胞；PANC-1 為人胰腺膽管瘤細胞。a 表示與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.110～6.902，均P<0.05）；b 表示與90Y 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.698、2.973、3.180、2.728，均P<0.05）。c 表示與DOTATOC 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.267～3.852，均P<0.05）

組別24 h腫瘤抑制率48 h腫瘤抑制率BON-1細胞PANC-1細胞BON-1細胞PANC-1細胞90Y-DOTATOC高劑量組44.12±2.23abc22.65±3.57abc67.73±0.98abc52.33±2.16abc90Y-DOTATOC中劑量組24.23±1.70ac15.56±4.47ac37.08±1.18ac26.39±1.80ac90Y-DOTATOC低劑量組17.94±1.71a10.52±4.08a31.58±1.32a14.15±1.75a DOTATOC組15.17±2.74a5.85±1.5823.43±3.90a8.45±2.33 90Y組8.23±2.117.45±1.8916.43±3.56a15.56±2.88a陽性對照組37.52±1.36a38.10±2.65a64.52±6.05a61.70±3.02a陰性對照組0000

3 討論

PRRT 是針對不能手術、系統(tǒng)性治療效果欠佳但SSTR 過表達的 NET 患者的一種有效且安全的治療方法[14]。在PRRT 相關藥物中，以90Y 和177Lu標記的生長抑素類似物DOTATOC 和DOTATATE的研究最為廣泛，其中177Lu-DOTATATE 已經(jīng)獲批上市，90Y-DOTATOC 具有很大的研究價值。本研究從細胞層面研究了90Y-DOTATOC 對BON-1（SSTR+）細胞的抑制作用，為90Y-DOTATOC 藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

DOTATOC 是一種奧曲肽類似物與螯合劑1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）連接后形成的一種化合物，可以被多種放射性核素（90Y、177Lu 等）標記。本研究結(jié)果顯示，90Y 標記DOTATOC 的標記率較其他文獻偏低[15]。其主要原因可能是本研究中的標記工藝條件并非最優(yōu)，如反應溫度、反應時間等。純化后的90Y-DOTATOC 的放射化學純度較高，表明純化方法能有效去除反應液中的游離90Y。90Y-DOTATOC 在生理鹽水和10%胎牛血清中的體外穩(wěn)定性較好，表明標記方法較為溫和，對DOTATOC 的破壞程度較小，完全能夠滿足后續(xù)細胞實驗要求。

在NET 治療方面，PRRT 具有諸多獨特的優(yōu)勢：（1）利用生長抑素類似物與SSTR 特異性結(jié)合的特點在生長抑素類似物上標記放射性核素，可將放射性核素導向SSTR 高表達的腫瘤；（2）在腫瘤原位發(fā)揮生物治療作用，生長抑素類似物可以抑制腫瘤細胞的增殖；（3）可發(fā)揮內(nèi)照射治療作用，放射性核素發(fā)射出β 粒子、俄歇粒子或內(nèi)轉(zhuǎn)換電子，可直接殺死腫瘤細胞。本研究結(jié)果顯示，與陰性組對比：（1）DOTATOC 組對BON-1 細胞的抑制作用顯著，差異有統(tǒng)計學意義，而對PANC-1 細胞的抑制作用不明顯；這可能是因為DOTATOC 能夠與BON-1 細胞表面的SSTR 受體結(jié)合，對細胞增殖起到一定的抑制作用，而DOTATOC 不能與PANC-1 細胞表面的SSTR 受體結(jié)合，對細胞增殖不具有抑制作用；（2）90Y-DOTATOC 對BON-1 和PANC-1 細胞均有不同程度的抑制作用，且抑制效果與90Y 的活度呈劑量依賴關系，這表明90Y 發(fā)出的β 射線能有效抑制腫瘤細胞增殖，90Y 活度越大，抑制效果越明顯；（3）90Y-DOTATOC 對PANC-1和BON-1 細胞的抑制作用明顯強于DOTATOC組；90Y-DOTATOC 高劑量組對BON-1 細胞的抑制率較DOTATOC 組提升約3 倍，這結(jié)果表明DOTATOC 通過放射性核素標記后對腫瘤細胞的殺傷作用明顯增強；（4）90Y 組因β 射線的作用，對2 組細胞均有一定的抑制作用；但在相同的放射性活度下，90Y 組對2 組細胞的抑制作用明顯低于90Y-DOTATOC 組，90Y 組對BON-1 細胞的抑制率約為90Y-DOTATOC 高劑量組的25%。

綜上所述，本研究制備的90Y-DOTATOC，標記率、放射化學純度、體外穩(wěn)定性均較好，DOTATOC 對BON-1 細胞有較強的親和力，靶向性較好，對BON-1 細胞有較強的抑制作用，且與90Y 的活度呈現(xiàn)劑量依賴關系。與單獨使用DOTATOC或者90Y 對比，90Y-DOTATOC 對BON-1 細胞的抑制作用更強。本研究為將90Y-DOTATOC 開發(fā)成一種治療NET（SSTR+）的藥物具有積極意義。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明王翰負責實驗方法的建立、現(xiàn)場實驗、論文的撰寫；鄧啟民負責實驗方法的建立與現(xiàn)場指導、論文的審閱；曾永龍等負責實驗方法的實施、實驗結(jié)果的收集與統(tǒng)計