房瑋 郭佳朋 王梓楨 連洋 王溪 樊國(guó)翔

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063200)

引言

隨著生活水平的提高，人們對(duì)畜禽肉蛋奶類的需求變得豐富多樣，而畜禽品質(zhì)的改良也成了科研工作者面臨的重要問題之一?；蚓庉嫾夹g(shù)是一種新興的生物技術(shù)，其可以精準(zhǔn)地修改生物體的基因組，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體性狀的精準(zhǔn)調(diào)控[1]?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)，為畜禽改良領(lǐng)域帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。畜禽改良是指通過人工選擇、人工繁殖等手段，改良畜禽的生產(chǎn)性能、品質(zhì)特征和抗病能力等方面的遺傳性狀，以提高畜禽的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[2]?；蚓庉嫾夹g(shù)的應(yīng)用，可以在畜禽改良中實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)、高效、可控的遺傳改良，為畜禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的動(dòng)力和支撐。

基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9是利用細(xì)菌天然的免疫系統(tǒng)中的CRISPR-Cas系統(tǒng)，通過特定的引物和酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)切割和編輯。CRISPR-Cas9技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、效率高、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為目前最為流行和廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)之一。在畜禽改良中，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，取得了一系列重要的研究進(jìn)展和應(yīng)用成果[3]。

可以利用CRISPR-Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽的生長(zhǎng)速度、肉質(zhì)品質(zhì)、抗病能力等方面的遺傳改良。這些遺傳改良可以提高畜禽的生產(chǎn)性能和品質(zhì)特征，從而增強(qiáng)畜禽產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)占有率[4]。

CRISPR/Cas9技術(shù)還可以用于畜禽的疾病防控。畜禽疾病是畜禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的重要問題，其不僅會(huì)導(dǎo)致畜禽的生產(chǎn)性能下降，還會(huì)對(duì)人類的健康和生命安全造成威脅。可以用CRISPR-Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽抗病基因的精準(zhǔn)編輯，從而提高畜禽的抗病能力和免疫力。這些抗病基因的編輯可以使畜禽更加健康、強(qiáng)壯，減少疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從而提高畜禽產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展能力[5]。

畜禽的基因資源是畜禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，包含了豐富的遺傳信息和生物多樣性。通過CRISPR-Cas9技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽基因資源的精準(zhǔn)保護(hù)和利用，從而促進(jìn)畜禽產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)保護(hù)[6]。

綜上所述，基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9可以用于畜禽的遺傳改良、畜禽的疾病防控、畜禽的基因保護(hù)和遺傳資源的利用等目標(biāo)[5，6]。因此，CRISPR/Cas9在畜禽改良方面的應(yīng)用為畜禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的動(dòng)力和支撐，具有廣泛的前景和重要的意義。

1 基因編輯技術(shù)的原理和方法

基因編輯技術(shù)是一種通過精確修改生物體的基因序列來改變其性狀的方法。目前常用的基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9等[7]。其中，CRISPR-Cas9技術(shù)是目前最為廣泛應(yīng)用的一種基因編輯技術(shù)，也是本文主要應(yīng)用的基因編輯技術(shù)。

CRISPR-Cas9技術(shù)的原理是利用一種天然存在于細(xì)菌中的防御機(jī)制，即CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以識(shí)別并剪切入侵細(xì)菌的病毒基因組，從而保護(hù)細(xì)菌免受病毒感染。CRISPR系統(tǒng)由一系列短重復(fù)序列和間隔序列組成，其中間隔序列中包含了來自病毒基因組的片段。這些片段可以被轉(zhuǎn)錄成RNA，與Cas蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，從而識(shí)別并剪切與這些片段相匹配的DNA序列[8]。利用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯的方法主要包括以下幾個(gè)步驟。

1.1 設(shè)計(jì)sgRNA

sgRNA是一種由CRISPR系統(tǒng)中的RNA和人工合成的RNA序列組成的復(fù)合物，用于指導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別并剪切目標(biāo)DNA序列。sgRNA的設(shè)計(jì)需要考慮到目標(biāo)基因的位置、長(zhǎng)度和特異性等因素。

1.2 合成sgRNA和Cas9蛋白

sgRNA和Cas9蛋白可以通過化學(xué)合成或基因工程技術(shù)進(jìn)行制備。合成后的sgRNA和Cas9蛋白可以通過轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中。

1.3 識(shí)別和剪切目標(biāo)DNA序列

sgRNA和Cas9蛋白復(fù)合物可以識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上，從而引導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)DNA序列。剪切后的DNA序列可以通過非同源末端連接或同源重組等方式進(jìn)行修復(fù)。

1.4 驗(yàn)證編輯效果

編輯后的細(xì)胞可以通過PCR、測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確定編輯效果是否達(dá)到預(yù)期。

CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效、精準(zhǔn)、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽改良、疾病治療、基因功能研究等領(lǐng)域[5]。

2 基因編輯技術(shù)在畜禽改良中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9已經(jīng)被廣泛用于改良畜禽的性狀，如提高畜禽肉的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高畜禽抗病性，提高畜禽生長(zhǎng)速度，提高蛋奶品質(zhì)等方面。目前已經(jīng)有許多研究報(bào)道了基因編輯技術(shù)在畜禽改良中的應(yīng)用，見表1。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在畜禽改良中的應(yīng)用

2.1 豬

利用CRISPR-Cas9技術(shù)可以精準(zhǔn)地編輯豬基因組中的抗病基因，提高豬對(duì)病原微生物的抵抗能力。如，F(xiàn)uminori等利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯了豬基因組中的CD163基因，使其不再受到豬瘟病毒的感染，從而提高了豬的抗病能力[9]；肌抑素基因(MSTN)限制了豬骨骼肌的生長(zhǎng)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將這種基因敲除后的豬(MSTN-KO)長(zhǎng)出更大的骨骼肌，從而有更多的肉產(chǎn)量，除此之外MSTN-KO表型已在牛、山羊和綿羊中引入[10]；利用CRISPR-Cas9技術(shù)將NANOS2基因敲除后的公豬(NANOS2-KO)可以引入其它具有生殖細(xì)胞遺傳優(yōu)勢(shì)公豬的基因，增強(qiáng)了這種豬的遺傳潛力[11]；利用CRISPR-Cas9技術(shù)還成功敲除豬的MHC系統(tǒng)，這種豬的器官可捐獻(xiàn)用于異種移植，并可用于免疫學(xué)研究[12]。

2.2 雞、鵪鶉

CRISPR/cas9可用于將雞細(xì)胞中chANP32A基因替換為增強(qiáng)禽類細(xì)胞中禽類聚合酶活性的huANP32A基因，使雞細(xì)胞中禽流感病毒增強(qiáng)的聚合酶活性降低，從而提高雞提供對(duì)禽流感的抗性。CRISPR/Cas9還可用在雞的基因組中引入類似rig-i的抗病基因，培育得到對(duì)禽流感具有更高抗性的雞，并且這種方法對(duì)多種禽類都適用[13]。

SCRISPR-cas9介導(dǎo)的鵪鶉MLPH基因敲除是將CRISPR-Cas9腺病毒載體直接注入鵪鶉胚皮，之后從鵪鶉嵌合體獲得后代。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些嵌合體后代MLPH基因有突變[14]；可以利用腺病毒CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的方法使靶向肌抑素(MSTN)基因在鵪鶉體內(nèi)產(chǎn)生突變。與雜合突變和野生型鵪鶉相比，MSTN純合突變型鵪鶉的體重和肌肉質(zhì)量顯著增加，脂肪百分比下降，心臟質(zhì)量增加[15]。

2.3 牛、羊

利用CRISPR-Cas9將NRAMP1基因被插入牛的基因組時(shí)，牛對(duì)牛分枝桿菌引起的牛結(jié)核病產(chǎn)生了耐藥性[16]。利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功替換了牛身上的異亮氨酰tRNA合成酶基因中的一個(gè)單個(gè)突變核苷酸，使之重新變回正常的異亮氨酰tRNA合成酶[17]。

綿羊的毛色是生產(chǎn)過程中必不可少的性狀，可以利用CRISPR-Cas9基因修飾技術(shù)，獲得不同顏色的綿羊被毛，毛色物理組成的差異很大程度上是基于CRISPR-Cas9的改變、突變和復(fù)制[18]；利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過在綿羊組織基因的非特異性堿性磷酸酶的單點(diǎn)插入，成功地制作了一種罕見的人類骨骼疾病——磷酸酶缺乏癥的大型動(dòng)物模板[19]。這些轉(zhuǎn)基因綿羊完美地復(fù)制了人類的低磷癥，為長(zhǎng)期研究低磷癥的發(fā)展和研究人類骨骼[20]的其他不尋常疾病都提供了一個(gè)新的領(lǐng)域；利用CRISPR-Cas9方法敲除綿羊的Myostatin基因，以改善綿羊的肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)。經(jīng)檢驗(yàn)與野生型綿羊相比，肌生成抑制素Myostatin基因缺失型綿羊的體重更高，這說明CRISPR-Cas9是一種利用基因敲除技術(shù)生產(chǎn)綿羊的有效方法[21]。CRISPR干預(yù)技術(shù)可在山羊的原代成纖維細(xì)胞中有效插入FGF，GDF8基因的單等位和雙等位KO基因，將這些單基因KO成纖維細(xì)胞用于SCNT過程，產(chǎn)生活著出生并具有FGF，GDF8雙等位變化的山羊[22]。CRISPR技術(shù)還被用來分析如硬脂酰輔酶A去飽和酶1的基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的作用[23]。

3 CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及在畜禽改良領(lǐng)域的未來發(fā)展方向

基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9與傳統(tǒng)的基因改良方法相比具有許多優(yōu)勢(shì)。CRISPR-Cas9可以實(shí)現(xiàn)精確的基因改良，避免了傳統(tǒng)基因改良方法中的隨機(jī)突變；CRISPR-Cas9可以快速地實(shí)現(xiàn)基因改良，縮短了基因改良的時(shí)間。但CRISPR-Cas9也存在一些局限性，如該系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生非常有害的脫靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)在隨機(jī)位點(diǎn)產(chǎn)生不利的突變，影響基因組修飾的精度，這引起了對(duì)安全性和有效性的擔(dān)憂，尤其是當(dāng)畜禽被飼養(yǎng)用于肉和蛋生產(chǎn)時(shí)[24]。

總體來說，CRISPR-Cas9在畜禽改良領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊，未來可以廣泛應(yīng)用于畜禽的改良。CRISPR-Cas9在提高各類畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的同時(shí)也能提高畜禽自身抗病性等[25]；此外，CRISPR-Cas9還可以用于研究農(nóng)業(yè)生物的基因功能和調(diào)控機(jī)制，為現(xiàn)代的大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供更多的科學(xué)依據(jù)和發(fā)展方向。