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        丙泊酚對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移、侵襲及AMPK/ mTOR/4EBP1通路的影響

        2023-07-04 16:25:00王紅梅劉巖劉俊江趙鑫
        中國現(xiàn)代醫(yī)生 2023年17期
        關(guān)鍵詞:丙泊酚

        王紅梅 劉巖 劉俊江趙鑫

        [摘要]?目的?研究丙泊酚對(duì)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響以及作用機(jī)制。方法?對(duì)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞采用不同濃度(0、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)丙泊酚進(jìn)行干預(yù),藥物處理48h,采用MTT法進(jìn)行篩選后,以5μg/ml丙泊酚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況,分為空白對(duì)照組(C組)、10μmol/L?Compound?C組(I組)、5μg/ml丙泊酚組(P1組)和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組(P2組)。采用Transwell法評(píng)估SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲能力,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測AMPK、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian?target?of?rapamycin,mTOR)和4EBP1及其磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果?P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組(P<0.05);比較C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與C組相比,P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào),且p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。C組、I組、P2組各蛋白表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論?丙泊酚可以抑制腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲,其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR/4EBP1信號(hào)通路有關(guān)。

        [關(guān)鍵詞]?丙泊酚;腎母細(xì)胞瘤;遷移和侵襲;AMPK/mTOR

        [中圖分類號(hào)]?R737.11??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.021

        Effect?of?propofol?on?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?cells?and?AMPK/mTOR/4EBP1?pathway

        WANG?Hongmei1,?LIU?Yan2,3,?LIU?Junjiang1,?ZHAO?Xin1

        1.The?First?Clinical?Medical?College?of?Mudanjiang?Medical?University,?Mudanjiang?157011,?Heilongjiang,?China;?2.Department?of?Anesthesiology,?Hengqin?Hospital?of?Zhuhai?Peoples?Hospital,?Zhuhai?519000,?Guangdong,?China;?3.Department?of?Anesthesiology,?Hongqi?Hospital?Affiliated?to?Mudanjiang?Medical?University,?Mudanjiang?157011,?Heilongjiang,?China

        [Abstract]?Objective?To?investigate?the?impact?and?mechanism?of?propofol?on?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?and?the?mechanism?of?action.?Methods?Intervention?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?with?different?concentrations?(0,?1μg/ml,?2μg/ml,?5μg/ml,?10μg/ml,?20μg/ml)?of?propofol,?drug?treatment?for?48h?and?screening?by?MTT?method?followed?by?5μg/ml?of?propofol?as?the?subsequent?experimental?dose.?The?SK-NEP-1?cells?were?divided?into?blank?control?group?(group?C),?10μmol/L?Compound?C?group?(group?I),?5μg/ml?propofol?group?(group?P1)?and?10μmol/L?Compound?C+5μg/ml?propofol?group?(group?P2)?according?to?the?administration?of?the?AMPK?inhibitor?Compound?C?and?propofol.?The?migratory?and?invasive?ability?of?SK-NEP-1?cells?was?assessed?by?Transwell?assay?and?the?expression?of?AMPK,?mammalian?target?of?rapamycin?(mTOR)?and?4EBP1?and?their?phosphorylated?proteins?were?detected?by?Western?blot.?Results?The?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?group?P1?was?significantly?less?than?that?in?group?C?(P<0.05).?Compared?the?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?groups?C,?I?and?P2,?the?differences?were?not?statistically?different?(P>0.05).?Compared?with?group?C,?the?expression?of?p-AMPK/AMPK?protein?was?up-regulated?and?the?expression?of?p-mTOR/mTOR?protein?and?p-4EBP1/4EBP1?protein?were?down-regulated?in?group?P1,?and?the?differences?were?statistically?significant?(P<0.05).?Compared?the?expression?levels?of?each?protein?in?group?C,?group?I?and?group?P2,?the?differences?were?not?statistically?significant?(P>0.05).?Conclusion?Propofol?can?inhibit?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells,?and?its?mechanism?could?be?linked?to?the?activation?of?the?AMPK/mTOR/4EBP1?signal?pathway.

        [Key?words]?Propofol;?Nephroblastoma;?Migration?and?invasion;?AMPK/mTOR

        腎母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期常見的腎臟惡性腫瘤,該病以無癥狀腹部腫塊為典型表現(xiàn)[1],近年來,由于現(xiàn)代外科技術(shù)、多種藥物化療和放療的配合使用,整體治療效果有了顯著提高,但是仍然存在部分病例預(yù)后不良,這與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放化療抵抗等有關(guān)[2]。丙泊酚作為小兒麻醉常用的靜脈麻醉藥,在腎母細(xì)胞瘤手術(shù)中應(yīng)用廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚麻醉可減少手術(shù)切除后多種癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,可在一定程度上延緩腫瘤發(fā)展的進(jìn)程[3],丙泊酚可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)其凋亡[4],但具體作用機(jī)制仍不明晰。AMPK/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian?target?of?rapamycin,mTOR)信號(hào)通路是近幾年的研究熱點(diǎn),AMPK激活后可以通過多種分子機(jī)制誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖抑制。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)非肌肉肌球蛋白ⅡA可通過在體外激活A(yù)MPK/mTOR途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Li等[6]發(fā)現(xiàn)丙泊酚可能通過調(diào)控AMPK信號(hào)途徑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期具有抑制作用,并促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在甲狀腺乳頭狀癌和肺癌等研究中發(fā)現(xiàn),AMPK/mTOR/4EBP1信號(hào)途徑的活化與其腫瘤細(xì)胞的浸潤及增殖抑制有一定關(guān)系[7-8]。但目前對(duì)于丙泊酚是否通過調(diào)控AMPK/mTOR通路對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲和遷移影響的研究未見報(bào)道。因此,本文旨在探索丙泊酚對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲及遷移及有關(guān)機(jī)制,為臨床上腎母細(xì)胞瘤手術(shù)中丙泊酚的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1??材料與方法

        1.1??材料

        人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司;含有10%胎牛血清的McCoys?5A培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生物有限公司;丙泊酚購自大連美侖生物有限公司(貨號(hào):MB?1613-S);DMSO及SDS-聚丙烯酰胺購自美國Sigma公司;AMPK、pAMPK及mTOR等抗體均購自美國Abcam公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海Beyotime?Biotechnology公司。

        1.2??分組

        將人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞于37℃條件下復(fù)蘇,然后將其懸浮于10%胎牛血清的McCoys?5A培養(yǎng)液中,于37℃及5%CO2環(huán)境中恒溫培養(yǎng)。將濃度為1×105/ml的SK-NEP-1細(xì)胞懸浮液接種在96孔板上,每個(gè)孔100μl。添加不同濃度丙泊酚(未添加丙泊酚、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)處理細(xì)胞48h,采用MTT法檢測丙泊酚對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明,與未添加丙泊酚的細(xì)胞相比,采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞,存活率變化不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);經(jīng)10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性(P<0.05)。因此,本研究選用對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞存活率無明顯作用的5μg/ml丙泊酚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。相對(duì)細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值–空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值–空白組吸光度值)×100%,檢測波長490nm。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況,將符合實(shí)驗(yàn)要求的SK-NEP-1細(xì)胞分為空白對(duì)照組(C組)、10μmol/L?Compound?C組(I組)、5μg/ml丙泊酚組(P1組)和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組(P2組)。

        1.3??方法

        1.3.1??SK-NEP-1細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測??采用Transwell法檢測SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲能力。①侵襲實(shí)驗(yàn):各組以不同濃度丙泊酚干預(yù)48h后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集,采用無血清McCoys?5A培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml后,接種到涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上腔,下腔灌注10%胎牛血清McCoys?5A培養(yǎng)基,并確保沒有氣泡產(chǎn)生。培養(yǎng)48h后,用甲醇固定并采用結(jié)晶紫染色法處理下室細(xì)胞,在顯微鏡(×100)下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)每視野的細(xì)胞數(shù)并成像。②遷移實(shí)驗(yàn):上室不加Matrigel基質(zhì)膠,余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。

        1.3.2??蛋白表達(dá)水平檢測??將各組細(xì)胞裂解離心后收集總蛋白,采用蛋白定量BCA法進(jìn)行含量分析。將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳法進(jìn)行分離,并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene?fluoride,?PVDF),封閉后與相應(yīng)的一抗在4℃條件下孵育過夜。采用TBST緩沖鹽溶液清洗3次,洗去未結(jié)合一抗,將膜與二抗(山羊抗兔IgG?1:5000)雜交后,繼續(xù)孵育1h,然后再洗滌PVDF膜3次,10min/次,使用微機(jī)顯影儀進(jìn)行曝光和顯影,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde?3-phosphate?dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參量,采用Image?J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

        1.4??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用GraphPad?Prism?8.0.2軟件對(duì)本文對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

        2??結(jié)果

        2.1??丙泊酚對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

        P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組(P<0.05);C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1。

        2.2??丙泊酚對(duì)AMPK、mTOR及4EBP1通路蛋白表達(dá)的影響

        與C組相比,P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)上調(diào),p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組、I組、P2組各蛋白表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

        3??討論

        腎母細(xì)胞瘤是小兒常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,目前臨床多采用以手術(shù)切除為主的多學(xué)科結(jié)合診療模式進(jìn)行治療[9]。大多數(shù)腎母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不佳是由于其高增殖、遷移和侵襲能力[10]。研究顯示,癌癥患者圍手術(shù)期的麻醉管理可以通過影響免疫系統(tǒng)、腫瘤血管生成和癌細(xì)胞的行為來影響腫瘤復(fù)發(fā)[11]。丙泊酚廣泛應(yīng)用于兒科麻醉,具有鎮(zhèn)吐和術(shù)后譫妄發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)體外研究表明,丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[12-14]?;仡櫺匝芯勘砻鳎c應(yīng)用揮發(fā)性麻醉藥相比,應(yīng)用丙泊酚進(jìn)行腫瘤外科手術(shù)的麻醉,能在一定程度上改善患者的生存率[15],但目前其具體機(jī)制尚不完全清楚。

        本研究結(jié)果顯示,在體外用丙泊酚干預(yù)SK-NEP-1細(xì)胞,用MTT實(shí)驗(yàn)檢測SK-NEP-1細(xì)胞活性,與未添加丙泊酚細(xì)胞相比,采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞,存活率變化不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性,以上結(jié)果與之前丙泊酚的抗腫瘤作用報(bào)道相符[14]。本研究選用5μg/ml丙泊酚作為實(shí)驗(yàn)劑量,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5μg/ml丙泊酚顯著降低穿膜細(xì)胞數(shù)目和遷移數(shù)目,提示丙泊酚可以在一定程度上抑制SK-NEP-1細(xì)胞的遷移和侵襲。

        AMPK/mTOR信號(hào)通路在腫瘤的遷移、侵襲、自噬和化療抵抗等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Song等[16]研究結(jié)果表明,ad-凋亡蛋白可能通過AMPK/mTOR信號(hào)途徑對(duì)人肺癌細(xì)胞的糖酵解、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用。AMPK激活劑AICAR可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,減弱轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá),并增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的化學(xué)敏感性[17]。Luan等[18]研究發(fā)現(xiàn),TIPRL誘導(dǎo)AMPK的磷酸化,繼而減弱了mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化,從而導(dǎo)致mTOR信號(hào)失活,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。mTOR、4EBP1及其磷酸化蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)[19-20],p-4EBP1的表達(dá)增加與前列腺癌患者的預(yù)后不良關(guān)系密切[21],但相關(guān)潛在的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

        本研究結(jié)果顯示,與C組相比,P1組中p-AMPK/?AMPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào),p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),提示丙泊酚可促進(jìn)細(xì)胞AMPK磷酸化,同時(shí)抑制mTOR、4EBP1蛋白活化水平,能夠激活A(yù)MPK/mTOR/4EBP1通路。為了探討丙泊酚抑制SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制與AMPK/mTOR/4EBP1通路是否有關(guān),本研究使用AMPK抑制劑Compound?C抑制AMPK磷酸化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組(P<0.05);C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示P2組經(jīng)Compound?C和丙泊酚共同處理后,基本上逆轉(zhuǎn)了丙泊酚對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

        綜上所述,丙泊酚可以抑制腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲,其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR/?4EBP1信號(hào)通路有關(guān)。但本研究存在一些局限性,首先,本研究只在單個(gè)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中進(jìn)行了研究,若同時(shí)使用其他細(xì)胞株將更好地驗(yàn)證丙泊酚對(duì)腎母細(xì)胞瘤的影響。其次,本研究沒有建立腫瘤模型來進(jìn)一步研究丙泊酚是否影響體內(nèi)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,未來均需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

        [參考文獻(xiàn)][1] CAO?J,?SUN?L,?AN?J,?et?al.?MicroRNA-200c-3p?inhibits?proliferation?of?nephroblastoma?cells?by?targeting?CCNE2[J].?Nan?Fang?Yi?Ke?Da?Xue?Xue?Bao,?2020,?40(9):?1246–1252.

        [2] SHI?Q,?TANG?B,?LI?Y,?et?al.?Identification?of?CDC20?as?a?novel?biomarker?in?diagnosis?and?treatment?of?wilms?tumor[J].?Front?Pediatr,?2021,?9:?663054–663064.

        [12] YE?L?L,?CHENG?Z?G,?CHENG?X?E,?et?al.?Propofol?regulates?miR-1-3p/IGF1?axis?to?inhibit?the?proliferation?and?accelerates?apoptosis?of?colorectal?cancer?cells[J].?Toxicol?Res,?2021,?10(4):?696–705.

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