高建有,匡美美,羅 慶,譚澤成,崔麗紅,查滿榮,劉世彪

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 吉首 416000)

獼猴桃(Actinidiachinensis)為營養(yǎng)豐富、富含維生素C的新興特色水果,在我國發(fā)展極快.獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是危害獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重病害.該病首次發(fā)現(xiàn)于湖南省東山峰農(nóng)場[1],由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起,可導(dǎo)致獼猴桃葉出現(xiàn)葉斑、花芽/葉芽褐變和脫落、果實皺縮、枝條頂端枯死甚至整株死亡等癥狀[2].潰瘍病具有爆發(fā)突然、易復(fù)發(fā)、傳播迅速、毀滅性強(qiáng)和難以根除等特點,已成為獼猴桃的“癌癥”.人們從不同角度探討了獼猴桃的抗病表現(xiàn),如韓明麗等[3]認(rèn)為樹體營養(yǎng)積累情況與潰瘍病抗性強(qiáng)弱有關(guān);李淼等[4]認(rèn)為枝條皮孔長度、密度與品種抗病性相關(guān).篩選和種植抗病品種是降低發(fā)病率的主要措施之一,目前已經(jīng)報道了多個抗性較強(qiáng)的品種[5-6].

湘西為湖南省獼猴桃主產(chǎn)區(qū),主要栽培品種為“米良一號”,兼植其他多個品種.近20年來潰瘍病在該區(qū)屢有發(fā)生,且部分果園病情極為嚴(yán)重[7].為此,本研究采用枝條致傷接菌法檢測了中華獼猴桃和美味獼猴桃13個栽培品種的潰瘍病抗性,測定了各獼猴桃品種的枝條皮孔性狀、可溶性糖和還原糖含量,以分析枝條含糖量與潰瘍病的關(guān)系,旨在為獼猴桃抗病性評價和抗病機(jī)理探討提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5年生中華獼猴桃(A.chinensis)品種“翠玉”“武植三號”“貝木”“金艷”“湘吉紅”“紅陽”“楚紅”“東紅”,以及美味獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)品種“米良一號”“米良二號”“湘碧玉”“湘吉”“貴長”共13個栽培品種,種植于吉首大學(xué)和湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院果園,管理水平一致.

獼猴桃潰瘍病菌株為P.syringaepv.actinidiastr. shaanxi-M228 (GCA 000344475.2),由湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 接種方法 (1)菌株培養(yǎng)方法.將致病菌株M228接種于溶菌肉湯固體培養(yǎng)基上,于25 ℃下培養(yǎng)36 h.挑取單菌落到LB液體培養(yǎng)基中,于25 ℃,180 r/min搖床上培養(yǎng)24 h后,在6 500 r/min的離心機(jī)中離心5 min,收集菌體,備用.

(2)離體枝條接種.參照Zhao等[8]方法配置菌懸液并稍作改變.收集菌體,用無菌水配置成吸光度值為0.2的菌懸液待用.采集一年生獼猴桃枝條,取中間部分(直徑8 mm,長15 cm),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的次氯酸鈉溶液表面消毒15 min,無菌水沖洗3～4次,每次10 min,自然晾干后,用石蠟將兩端切口封口.用無菌美工刀在枝條中間部位劃傷樹皮至木質(zhì)部(寬1 mm),用10 uL移液槍向切口處注入10 uL菌懸液,靜置15 min,待菌液從木質(zhì)部滲入.每種供試枝條30個.在底部貼2層無菌濾紙的無菌托盤中加入無菌水保持濕度,上置無菌培養(yǎng)皿,將接種后的枝條擺放在培養(yǎng)皿上,切口朝上,每培養(yǎng)皿中5個枝條,用保鮮膜將托盤封口,置于光照和黑暗時段比16 h/8 h、晝夜溫度比16℃/10℃的光照培養(yǎng)箱中.

1.3 枝條性狀觀測

1.3.1 皮孔數(shù)量及皮層厚度測定 實驗當(dāng)天(0天)隨機(jī)選取1個培養(yǎng)皿中5個枝條,用美工刀在枝條中間部位剝下長5 cm的一圈樹皮,觀察其皮孔排列方式,記錄皮孔數(shù)目,計算皮孔密度.用游標(biāo)卡尺測量皮孔長度和皮層厚度,取平均值分析.

1.3.2 病斑長度測定及抗性等級評價 分別于接種M228后5,10,15,20,25 d隨機(jī)取樣,每次選取1個培養(yǎng)皿中5個枝條,用美工刀剝?nèi)テ雍?觀察木質(zhì)部褐變程度,并用游標(biāo)卡尺測量病斑長度.

抗性評價參照溫欣[9]方法略作調(diào)整.根據(jù)病斑長度將抗病性劃分為“高抗”“抗”“中抗/中感”“感”“高感”5個等級.高抗：韌皮部僅在接種處出現(xiàn)長度小于5 mm的褐變,且褐變不明顯.抗：接種處附近5～10 mm出現(xiàn)褐變,且有局部組織壞死.中抗/中感：傷口附近10～20 mm處發(fā)生褐變,且有木質(zhì)部局部褐變.感：傷口附近20～30 mm發(fā)生褐變,且有局部木質(zhì)部褐變.高感：局部褐變范圍超過30 mm,且木質(zhì)部發(fā)生顯著褐變.每次以5個枝條病斑長度平均值評價抗病性,以第25天觀察結(jié)果為最終依據(jù).

1.3.3 皮層的含糖量測定 (1)皮層取樣.將第0天用于皮孔數(shù)量及皮層厚度測定后的5個離體枝條,以及第25天病斑測定后的5個離體枝條,用無菌美工刀刮去枝條周皮,以接菌口為中點向兩端各削取2.5 cm長皮層,測定皮層的糖含量,取平均值分析.

(2)可溶性糖和還原糖的測定.采用乙醇提取法、蒽酮比色法和3,5-二硝基水楊酸比色法,測定接種枝條皮層中的可溶性糖和還原糖含量.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對各品種的病斑長度、皮孔長度、皮孔密度和皮層厚度進(jìn)行差異顯著性比較,將皮孔長度、皮孔密度、皮層厚度、枝條含糖量與病斑長度(抗病性)作相關(guān)性分析.

2 結(jié)果

2.1 不同獼猴桃品種的潰瘍病抗性

8個中華獼猴桃栽培品種在接種病原菌后25天期間的病斑長度如圖1(a)所示.由圖1(a)可知：接種后5天均未檢出病斑,第10天除“翠玉”和“楚紅”外,均有病斑出現(xiàn),以“紅陽”病斑最長.病斑隨觀測時間延長而加長,其中“紅陽”的病斑在所有受試品種中一直保持最長.第15天時“貝木”病斑長度升到第二,“楚紅”病斑最短.第20天時“貝木”和“湘吉紅”病斑長度仍較高,“楚紅”最短.第25天時“紅陽”病斑長度達(dá)37.43 mm,顯著高于其他品種病斑長度,“東紅”雖然在前期病斑較小,但在25天時病斑長度急劇上升至25.57 mm,位居第二,反映出病菌具有較長潛伏期和急劇爆發(fā)性特點.“貝木”“湘吉紅”“金艷”和“武植三號”的病斑長度相差較小,均顯著低于“紅陽”和“東紅”.“翠玉”和“楚紅”發(fā)病遲、病斑小,表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病能力.根據(jù)潰瘍病枝條抗性評價標(biāo)準(zhǔn),中華獼猴桃8個品種的抗病性由強(qiáng)到弱依次為“楚紅”(抗)、“翠玉”(抗)、“貝木”(中抗/中感)、“湘吉紅”(中抗/中感)、“武植三號”(中抗/中感)、“金艷”(中抗/中感)、“東紅”(感)、“紅陽”(高感).

圖中相同培養(yǎng)時間不同小寫字母代表相同培養(yǎng)時間不同品種間差異顯著(P<0.0.5).圖1 獼猴桃栽培品種離體枝條病斑長度Fig.1 Disease Spot Length on Isolated Branch of Kiwifruit Cultivars

5個美味獼猴桃栽培品種在接種病原菌后25天內(nèi)的病斑長度變化如圖1(b)所示.由圖1(b)可知：前5天所有品種均未發(fā)病,第10天“貴長”病斑明顯,其后一直均為最長.第10天“湘碧玉”出現(xiàn)病斑,第15天所有品種均出現(xiàn)病斑.第20天時“湘吉”與“湘碧玉”的病斑長度等長,均高于“米良一號”和“米良二號”.第25天時“貴長”褐斑達(dá)27.25 mm,顯著高于其他品種,表現(xiàn)出高感特性;“湘吉”和“湘碧玉”的感病現(xiàn)象也較明顯,而“米良一號”和“米良二號”不僅發(fā)病較晚,其在第25天時的病情也較輕,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性.

綜上,13個栽培品種的抗病性由強(qiáng)到弱依次為“米良一號”(高抗)、“米良二號”(抗)、“楚紅”(抗)、“翠玉”(抗)、“貝木”(中抗/中感)、“湘碧玉”(中抗/中感)、“湘吉”(中抗/中感)、“湘吉紅”(中抗/中感)、“武植三號”(中抗/中感)、“金艷”(中抗/中感)、“東紅”(感)、“貴長”(感)、“紅陽”(高感).

2.2 獼猴桃枝條皮孔性狀和皮層厚度與潰瘍病抗性

13個獼猴桃品種枝條的皮孔和皮層性狀如表1所示.由表1可知：各品種在皮孔密度、皮孔長度、皮孔排列方式及皮層厚度上存在較大差異.“湘吉”皮孔密度最少,僅為2.4個/cm2,“湘碧玉”皮孔密度最大,高達(dá)14.4個/cm2.“貴長”皮孔長度最短,僅為0.66 mm,以“紅陽”皮孔長度最長,為2.672 mm.“楚紅”皮層厚度最小,為0.49 mm,“紅陽”皮層厚度最大,為1.1 mm.相關(guān)性分析顯示,13個品種的皮孔長度、皮孔密度和皮層厚度與各自潰瘍病抗性的相關(guān)系數(shù)分別為0.284,0.707和0.490,表明這些指標(biāo)與潰瘍病抗性沒有明顯相關(guān)性.

表1 獼猴桃枝條皮孔和皮層性狀Table 1 Characters of Lenticel and Cortex in Branches of Kiwifruit Cultivars

2.3 獼猴桃枝條含糖量與潰瘍病抗性

2.3.1 可溶性糖與潰瘍病抗性 可溶性總糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖等,是植物重要的碳水化合物,也是細(xì)菌生存的能量來源.枝條皮層中的可溶性糖含量變化可能反映感病后獼猴桃維持生存的能量變化動態(tài).中華獼猴桃處理前后枝條可溶性糖含量變化如圖2(a)所示.由圖2(a)可知：8個品種枝條可溶性糖含量隨感病時間增長均呈現(xiàn)出下降趨勢.獼猴桃枝條感病前可溶性糖含量大致可分為兩組：高糖組(16 mg/g以上)有“楚紅”“湘吉紅”“武植三號”和“紅陽”;低糖組(16 mg/g以下)有“東紅”“貝木”“翠玉”和“金艷”.處理25天后按枝條可溶性糖含量亦可將獼猴桃分為兩組：高糖組(12 mg/g以上)有“湘吉紅”“楚紅”“武植三號”和“翠玉”;低糖組(12 mg/g以下)有“貝木”“東紅”“紅陽”和“金艷”.其中有6個品種的枝條可溶性糖含量維持在原來組別,“紅陽”感病后由高糖組急劇下降至低糖組,“翠玉”則由低糖組急劇上升至高糖組.與圖1(a)中病斑大小作相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)總體趨勢為感病后高糖組的潰瘍病抗性相應(yīng)較強(qiáng)(“楚紅”(抗)、“翠玉”(抗)、“湘吉紅”(中抗/中感)、“武植三號”(中抗/中感)),而低糖組抗病性相對較弱(“貝木”(中抗/中感)、“金艷”(中抗/中感)、“東紅”(感)、“紅陽”(高感)).經(jīng)相關(guān)性分析,接菌前、后的枝條可溶性糖含量與抗性的相關(guān)性系數(shù)分別為0.641和-0.202,雖未達(dá)到顯著水平,但大概率反映了感病植株營養(yǎng)狀況與抗病性的關(guān)系,尤以抗病的“楚紅”和“翠玉”,感病和高感的“東紅”和“紅陽”最為明顯.

圖2 獼猴桃品種枝條的可溶性糖含量變化Fig. 2 Content of Soluble Sugar in Branches of Kiwifruit Cultivars

美味獼猴桃處理前后枝條可溶性糖含量變化如圖2(b)所示.由圖2(b)可知：5個美味獼猴桃品種枝條處理25天后,可溶性糖含量同樣呈下降趨勢.感病前枝條可溶性糖含量以“米良二號”最高,“貴長”最低,“米良一號”和“湘碧玉”高于“湘吉”.感病25天時各品種可溶性糖含量仍保持上述順序.與圖1(b)中病斑大小作相關(guān)性分析,也顯示出感病后可溶性糖含量較高的品種抗病能力較強(qiáng),可溶性糖含量較低的品種抗病能力較弱(“米良一號”(高抗)、“米良二號”(抗)、“湘碧玉”(中抗/中感)、“湘吉”(中抗/中感)、“貴長”(感)).中華獼猴桃與美味獼猴桃相比,前者大部分品種枝條的含糖量在感病前后高于后者,且前者在感病期間的下降程度略高于后者.

2.3.2 還原糖與潰瘍病抗性 中華獼猴桃處理前后枝條還原糖含量變化如圖3(a)所示.由圖3(a)可知：8個品種枝條還原糖含量隨感病時間增長總體呈上升趨勢.感病前枝條還原糖含量在3 mg/g以上的高糖組有“楚紅”“武植三號”“東紅”和“紅陽”,3 mg/g以下的低糖組有“湘吉紅”“翠玉”“金艷”和“貝木”.感病25天時,除“楚紅”枝條還原糖含量下降外,其余品種枝條還原糖含量均上升,以“金艷”最高,“紅陽”最低.美味獼猴桃處理前后枝條還原糖含量變化如圖3(b)所示.由圖3(b)可知：5個品種枝條經(jīng)過處理后,還原糖含量同樣呈上升趨勢,感病前枝條還原糖含量以“湘碧玉”最高,“貴長”最低,感病25天時以“湘吉”最高,“湘碧玉”最低.相關(guān)性分析顯示,接菌前、后枝條還原糖含量與抗性的相關(guān)性系數(shù)分別為0.831和0.785,說明各品種枝條還原糖含量與潰瘍病抗性無明顯相關(guān)性.

3 討論

獼猴桃潰瘍病是威脅獼猴桃生產(chǎn)的毀滅性病害,雖然研究者對Psa的致病機(jī)理和抗病分子機(jī)理已取得一些研究成果[10-12],并開發(fā)出一些防治措施[13-15],但選用抗性品種仍是目前預(yù)防該病最有效和實用的方法,而其前提則是對現(xiàn)有品種抗病性進(jìn)行充分的了解和評價.不同獼猴桃品種對Psa的敏感程度不同,王發(fā)明等[16]對9個紅肉獼猴桃品種的潰瘍病抗性分析顯示,“楚紅”的抗性較強(qiáng).本研究結(jié)果支持這一結(jié)論,中華獼猴桃中“翠玉”不僅在室內(nèi)表現(xiàn)為抗性較強(qiáng),在田間也表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病性[7].張慧琴等[17]通過室內(nèi)離體接種方法探究了18個不同獼猴桃品種的抗病性,發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃和美味獼猴桃各受試材料之間的抗病性差異較大.“米良一號”是湘西地區(qū)獼猴桃主栽品種,本研究發(fā)現(xiàn)其在室內(nèi)具有較高的抗病性.此外,“米良一號”在中低海拔地區(qū)也具有較強(qiáng)的抗寒性和抗旱性,但近年有研究報道,生產(chǎn)園的“米良一號”也有潰瘍病發(fā)生,這與海拔、低溫、降雨和管理水平直接相關(guān)[7,18].因此,預(yù)防獼猴桃潰瘍病要考慮包括品種抗病性在內(nèi)的綜合因素.

學(xué)者們很感興趣能否從枝條形態(tài)特征快速判斷獼猴桃潰瘍病抗病性強(qiáng)弱.李淼等[4]報道獼猴桃抗病性與枝條皮孔大小和密度成正相關(guān),皮孔分布密集且上下排列成直線的品種容易感病,而分布稀疏排列隨機(jī)的品種則不易感病.本研究結(jié)果顯示,獼猴桃的抗病性與皮孔密度、長度、排列方式和皮層厚度并無明顯相關(guān)性.雖然Psa可通過皮孔、氣孔等開口入侵,但在自然條件下Psa受皮孔密度和排列方式制約的機(jī)率應(yīng)是極小的,更大機(jī)率是從冬季修剪傷口入侵.

糖類是獼猴桃生存的能量儲存和轉(zhuǎn)移介質(zhì),是抗逆性強(qiáng)弱的基礎(chǔ),是Psa代謝的能量來源,也是樹體和病原菌爭奪的代謝底物.李淼等[19]報道,發(fā)病后獼猴桃枝條的可溶性糖含量均降低,但感病品種的枝條可溶性糖含量顯著下降.本研究發(fā)現(xiàn),感病后獼猴桃枝條的可溶性糖含量降低,且糖含量降低后仍維持在較高水平的品種,其抗病性較強(qiáng);反之,枝條可溶性糖含量降低至較低水平的品種,其抗病性較弱,這與筆者最近發(fā)表的敏感和高感獼猴桃在接種潰瘍病菌后蔗糖含量下降更多的觀點是一致的[20].尤其是抗病性最弱的“紅陽”品種,感病前枝條可溶性糖含量較高,而感病后枝條可溶性糖含量較低,其原因可能在于病情發(fā)展過程中Psa要消耗大量糖分,植株為維持自身代謝、增強(qiáng)“免疫力”也需要消耗更多能量,致使糖源供應(yīng)不繼而病情加重.本研究中,13種獼猴桃品種枝條還原糖含量變化與可溶性糖含量變化基本呈相反趨勢,感病后枝條還原糖含量呈增加態(tài)勢,但含量大小與抗病性強(qiáng)弱并無明顯關(guān)系.究其原因,還原糖不僅能為植物提供能源,可能也會作為一種信號物質(zhì)行使微量高效的調(diào)節(jié)作用,或者較高的還原糖含量更有利于病原菌的快速繁殖,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究.