周明 劉敏

慢性萎縮性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)是以不典型消化道癥狀為主要臨床表現(xiàn)的慢性消化系統(tǒng)疾病[1],隨著病情發(fā)展,常伴腸上皮化生或不典型增生[2-3],被視為胃癌的癌前疾病[4]。中醫(yī)藥在減輕患者臨床癥狀,延緩或逆轉(zhuǎn)病理進展方面有確切效果[5-6]。

薏苡仁、浙貝母為中醫(yī)臨床治療脾胃病的常用藥。根據(jù)《中華人民共和國藥典(2020版)》記載,薏苡仁具有健脾滲濕、解毒散結(jié)等功效[7]。用于慢性萎縮性胃炎的治療符合CAG本虛標實的病機共識[8-9]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),薏苡仁除有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫、鎮(zhèn)痛抗炎、調(diào)節(jié)代謝、抗氧化等作用外,還有明確抗腫瘤效果,以其為原料藥開發(fā)的康萊特系列藥物已廣泛用于多種癌癥的臨床治療[10]。浙貝母是一味化痰藥,傳統(tǒng)認為其具有清熱化痰、解毒散結(jié)等功效。而《景岳全書本草正》謂其“善開郁結(jié),止疼痛,消脹滿”[11],可見浙貝母也能理中焦之氣,可用來緩解CAG常見的脘腹脹滿。此外,“百病多由痰作祟”,對于脾胃病中疑難者,國醫(yī)大師徐景藩先生臨證常配浙貝母,往往都有不錯療效[12-13]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),浙貝母具有祛痰、抗炎、抗菌、抗?jié)冏饔?同時也常用于腫瘤治療[14]。兩藥配伍,在緩解CAG臨床癥狀、減輕炎癥反應、抑制“炎癌轉(zhuǎn)化”等方面有可預期的效果。目前,單獨針對薏苡仁或浙貝母的基礎研究較為普遍,而對于薏苡仁—浙貝母藥對及其治療CAG的藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制研究相對較少,值得進一步探究。

網(wǎng)絡藥理學基于生物學、藥理學、計算機技術(shù)等多學科交叉融合的系統(tǒng)生物學理論,構(gòu)建“藥物—成分—靶點—通路”的相互作用網(wǎng)絡,符合中藥研究的需求,能夠系統(tǒng)的揭示藥物起效的作用機制[15-16]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學理論和方法,篩選薏苡仁—浙貝母藥對治療CAG的活性成分及對應作用靶點[17],探尋其可能的作用機制,以期為CAG治療用藥的進一步開發(fā)和應用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 薏苡仁—浙貝母活性成分及對應靶點篩選

以“薏苡仁”“浙貝母”為關(guān)鍵詞,運用TCMSP平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[18]檢索兩藥的化學成分。根據(jù)藥物代謝動力學特性,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)及類藥性(drug-likeness,DL)[19]分別大于等于30%和0.18為條件,篩選薏苡仁—浙貝母藥對的候選活性成分。

以“薏苡仁”“浙貝母”為關(guān)鍵詞,在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找藥對所有靶點,并利用Perl語言腳本及候選活性成分數(shù)據(jù)篩選對應靶點。進一步在UniProt 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)下載人類基因注釋文件[20],將靶點名稱轉(zhuǎn)換為標準基因名,用于后續(xù)分析處理。

1.2 慢性萎縮性胃炎疾病相關(guān)靶點篩選

以“atrophic gastritis”或“gastritis”為關(guān)鍵詞,檢索在線疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)及TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[21],分別下載CAG相關(guān)疾病靶點,利用R語言“venn”程序包進行篩選、整理,獲取疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)。

1.3 薏苡仁—浙貝母治療CAG作用靶點預測及中藥—活性成分—作用靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

將薏苡仁—浙貝母藥對候選活性成分對應靶點基因與CAG疾病相關(guān)靶點基因進行匹配,獲得的兩者共同基因,即為薏苡仁—浙貝母治療CAG的作用靶點。同時利用以上數(shù)據(jù),通過Perl語言腳本建立“中藥—活性成分—作用靶點”映射關(guān)系,使用Cytoscape 3.9軟件進行網(wǎng)絡繪制及相應分析[22]。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建與核心靶點篩選

使用預測出的作用靶點,在STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)網(wǎng)站,選擇物種為人(Homo sapiens),設置置信度≥0.4,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-Protein Interaction,PPI)[23],保存網(wǎng)絡圖及TSV格式分析結(jié)果。使用Cytoscape及其插件CytoNCA對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析,計算網(wǎng)絡中各節(jié)點的介度中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)、 特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、局部邊連通性(local average connectivity-based method centrality,LAC)和網(wǎng)絡中心性(network centrality,NC)[24],選出5個篩選指標均大于相應中位數(shù)的節(jié)點,即為篩選出的核心靶點,并構(gòu)建核心靶點間的網(wǎng)絡關(guān)系。

1.5 基因本體富集與京都基因與基因組百科全書通路富集分析

使用R語言完成富集分析,涉及 “clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”“pathview” 等相關(guān)程序包。薏苡仁—浙貝母治療CAG作用靶點的基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析具體包含生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三部分[25],在結(jié)果中選擇各部分顯著富集的前10項繪制柱狀圖。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析用來搜索作用靶點涉及的主要信號通路[26],選擇顯著富集的前30項通路條目繪制氣泡圖。兩富集分析均以P值及矯正P值小于0.05為篩選標準。

1.6 分子對接驗證

在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索下載核心靶點對應活性成分的2D數(shù)據(jù),利用ChemOffice 14.0軟件構(gòu)建3D結(jié)構(gòu),以mol2格式保存。核心靶點的3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)獲取,靶蛋白3D結(jié)構(gòu)中包含的水分子和小分子配體均由PyMOL-2.4.0軟件去除。蛋白加氫、活性成分及靶蛋白的格式轉(zhuǎn)換及活性口袋的預設置,均在AutoDockTools-1.5.7軟件平臺處理。分子對接使用Autodock Vina軟件完成,通過結(jié)合能計算驗證活性成分與靶蛋白的結(jié)合能力。PyMOL-2.4.0軟件用于對接結(jié)果的可視化。

2 結(jié)果

2.1藥對活性成分及對應靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,對薏苡仁、浙貝母分別進行成分搜索,以 OB≥30%,DL≥0.18 為篩選條件,共得到16個候選活性成分,其中薏苡仁9個、浙貝母7個,活性成分相關(guān)信息見表1。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中薏苡仁—浙貝母藥對活性成分相關(guān)信息

通過檢索,獲得薏苡仁—浙貝母藥對所有靶基因共356個,其中薏苡仁246個,浙貝母110個。利用UniProt數(shù)據(jù)庫下載的人類基因數(shù)據(jù)以及Perl語言腳本,將查詢到的靶基因進行去重、篩選、規(guī)范基因名稱,最終獲得候選活性成分對應的靶基因數(shù)據(jù)98條。

2.2 慢性萎縮性胃炎疾病相關(guān)靶點

通過1.2中所述五個疾病數(shù)據(jù)庫下載有關(guān)CAG的疾病相關(guān)靶點。利用R語言“venn”程序包進行分析,去除重復基因,取并集,合計獲得769個疾病靶點,其中DrugBank 18個,GeneCards 449個,OMIM 197個,PharmGkb 159個,TTD 1個,繪制韋恩圖,結(jié)果見圖1。

圖1 5個疾病數(shù)據(jù)庫所得慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點取并集之韋恩圖

2.3 薏苡仁—浙貝母治療CAG作用靶點及中藥—活性成分—作用靶點網(wǎng)絡圖分析

通過Perl語言腳本,對藥對候選活性成分對應靶基因與CAG疾病相關(guān)靶點進行整理后取交集,得到12個共有靶點,即為預測出的薏苡仁—浙貝母治療CAG的作用靶點,對應7個活性成分,準備網(wǎng)絡構(gòu)建及分析的關(guān)系文件。

將關(guān)系文件導入Cytoscape 3.9軟件,生成中藥—活性成分—作用靶點相互作用網(wǎng)絡圖,如圖2所示,節(jié)點代表活性成分或作用靶點,節(jié)點連線說明成分與靶點之間產(chǎn)生相互聯(lián)系。圖中節(jié)點越大其關(guān)聯(lián)的活性成分或作用靶點越多,此節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要。結(jié)果顯示,7個活性成分中degree值>3的有MOL000358(β-谷甾醇,beta-sitosterol,degree值為8)、MOL001004(天竺葵素,pelargonidin,degree值為5)、MOL000449(豆甾醇,Stigmasterol,degree值為3)。β-谷甾醇和天竺葵素來自浙貝母,豆甾醇為薏苡仁的活性成分。β-谷甾醇degree值為8,表示其與12個靶基因中的8個發(fā)生聯(lián)系。

注:圖中紫色節(jié)點代表來自浙貝母的活性成分,綠色節(jié)點代表來自薏苡仁的活性成分,藍色節(jié)點表示藥對活性成分調(diào)控慢性萎縮性胃炎的作用靶點。

2.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

蛋白相互作用分析顯示,薏苡仁—浙貝母治療CAG的12個作用靶點間共產(chǎn)生34條相互作用關(guān)系。進一步采用CytoNCA對網(wǎng)絡的拓撲屬性進行分析,篩選大于所有指標中位值的節(jié)點,得到5個核心靶點,分別為PTGS2、CASP3、CASP8、JUN、PPARG,如圖3所示,進一步建立核心靶點間的互作關(guān)系網(wǎng)絡。

注:圖中黃色節(jié)點為經(jīng)拓撲分析篩選出的核心靶點

2.5 GO富集及KEGG通路富集分析

12個作用靶點的“gene symbol(基因名)”通過R語言“org.Hs.eg.db”程序包轉(zhuǎn)換為“entrezID”,“enrichplot”程序包用于GO富集分析。分別選取在BP、MF、CC上顯著富集的前10個條目繪制柱狀圖,如圖4所示。分析結(jié)果顯示,薏苡仁—浙貝母治療CAG的作用靶點在生物過程方面主要與脂多糖、細菌來源分子及氧水平降低等反應相關(guān);在細胞組成上主要位于細胞器外膜、線粒體外膜、膜微域等;在分子功能方面主要包括血紅素結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、四吡咯結(jié)合等。

注:縱坐標表示富集到的GO條目名稱,橫坐標表示富集到的基因數(shù)目。

作用靶點的KEGG通路富集分析使用 “enrichplot”和“pathview”程序包,以P值及矯正P值均小于0.05進行篩選,結(jié)果得到87條富集的信號通路。選擇前30條通路繪制氣泡圖,見圖5。分析顯示,薏苡仁—浙貝母治療CAG的作用靶點主要富集在白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號通路、P53信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)信號通路等。以IL-17信號通路為例,通路中主要富集了PTGS2、JUN、CASP3、CASP8等靶基因,見圖6。

注:縱坐標為富集到的通路名稱,橫坐標為參與該通路的靶點占總靶點的比例。

圖6 薏苡仁—浙貝母藥對治療慢性萎縮性胃炎作用靶點在IL-17信號通路上的富集圖

2.6 活性成分及核心靶點的分子對接驗證

根據(jù)“中藥—活性成分—作用靶點”網(wǎng)絡圖中活性成分degree值排名,將薏苡仁—浙貝母藥對治療CAG的核心靶點PTGS2、CASP3、CASP8、JUN、PPARG與對應的活性成分進行分子對接。配體與受體的結(jié)合能越低,說明兩者形成的復合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,也預示著兩者有較大的可能發(fā)生相互作用。一般情況下以結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol作為穩(wěn)定結(jié)合的評判標準[27]。結(jié)果顯示,5個核心靶點與對應活性成分的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol,表明核心靶點與活性成分有較好的結(jié)合能力,對接結(jié)果見表2。利用PyMOL軟件對結(jié)果進行可視化,以PTGS2蛋白分子對接結(jié)果為例進行展示,對接模式圖見圖7。

圖7 薏苡仁—浙貝母藥對活性成分與PTGS2蛋白分子對接模式圖

表2 薏苡仁—浙貝母藥對核心作用靶點與對應活性成分分子對接結(jié)果

3 討論

上世紀90年代,有學者提出胃炎的“炎癌轉(zhuǎn)化”路徑,即慢性非萎縮性胃炎—慢性萎縮性胃炎—腸上皮化生—異型增生—胃癌,被醫(yī)學界廣泛認可[28]。有研究表明,我國萎縮性胃炎發(fā)病率在2014年已約占受檢人群的25%,并且呈逐年上升趨勢[29]。目前,常規(guī)治療CAG多用于緩解臨床癥狀,尚不能滿足臨床治愈的需求,且長期使用質(zhì)子泵抑制劑等藥物對胃腸道有明顯副作用[30-31]。中藥副作用小,其協(xié)同起效特征在復雜疾病的治療中具有一定優(yōu)勢[32]。近年來越來越多的臨床醫(yī)生和患者開始關(guān)注并使用中醫(yī)藥來預防和治療CAG[33],尋找治療CAG效果確切的中藥,并明確其作用機制具有重要的社會意義。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學理論和方法,篩選出薏苡仁—浙貝母藥對治療CAG的7個主要生物活性成分,映射12個CAG作用靶點。其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)與核心靶點有著廣泛的結(jié)合作用。β-谷甾醇作為甾醇類化合物,有明確的抗炎作用,其可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3,最終抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的激活,使得細胞中的白細胞介素-6、白細胞介素-8等炎癥因子生成減少而起效[34]。同時,有研究表明,β-谷甾醇能夠緩解阿司匹林導致的胃黏膜損傷,促進愈合,有一定的保護胃黏膜效果[35]。此外,β-谷甾醇具有抗菌作用,動物實驗顯示β-谷甾醇可使結(jié)腸炎模型小鼠腸上皮細胞、巨噬細胞上抗菌肽的表達顯著增加,降低腸道菌的存活率,并且對肺炎鏈球菌、金黃葡萄球菌等均有抑制效果[36-38],或?qū)刂艭AG相關(guān)的幽門螺桿菌感染有一定作用。另有研究表明β-谷甾醇對胃癌有治療效果,可抑制腫瘤細胞增值及誘導其凋亡[39-40],可見其或可延緩或逆轉(zhuǎn)CAG的“炎癌轉(zhuǎn)化”過程。

本研究通過PPI網(wǎng)絡拓撲分析,進一步篩選到5個核心靶點,包括PTGS2、CASP3、CASP8、JUN、PPARG,其中PTGS2與多個活性成分關(guān)聯(lián)。PTGS2又稱環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),是前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)形成的關(guān)鍵酶,后者有強烈的促炎作用,因此PTGS2與抗炎功效關(guān)系密切,一直是非甾體類抗炎藥的重要靶點。此外,PTGS2是一種誘導型蛋白,正常組織或細胞中極少表達,當機體受到炎癥因子、腫瘤促進劑、生長因子等因素刺激時表達上升[41],參與炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)、細胞增殖與凋亡等多種病理過程,并且與多種癌腫的發(fā)生密切相關(guān)[42-43]。本研究KEGG通路分析結(jié)果中涉及到的IL-17、TNF、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等炎癥、腫瘤相關(guān)信號通路均與PTGS2基因有密切聯(lián)系,表明PTGS2在薏苡仁—浙貝母藥對治療CAG中,通過抗炎、抗腫瘤機制起著重要作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,大多數(shù)靶標蛋白的編碼基因富集在與CAG“炎癌轉(zhuǎn)化”相關(guān)的IL-17信號通路、P53信號通路和TNF信號通路上。研究證實IL-17信號通路在急慢性炎癥反應中扮演著重要角色,IL17家族有6個成員(IL-17A-F),可通過與相應受體結(jié)合,激活下游MAPK,NF-κB和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白通路中的抗細胞因子、趨化因子和抗菌肽,與CAG的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)[44-45]。P53信號通路是一經(jīng)典的腫瘤相關(guān)通路,P53蛋白可促細胞凋亡,在腫瘤抑制中具有重要作用,其失活會促進腫瘤發(fā)生或發(fā)展,大量基因組測序證實,約一半的腫瘤伴有P53基因突變[46]。有研究發(fā)現(xiàn),隨著慢性胃炎程度的加重,患者胃黏膜中突變型P53基因表達明顯升高[47],可見薏苡仁—浙貝母通過對P53通路的調(diào)控,或可減緩CAG病情惡化。TNF通路是與腫瘤和炎癥均有關(guān)的信號通路,TNF-α可直接殺傷腫瘤細胞,同時參與全身炎癥反應,其與相應受體結(jié)合后可激活下游,包括NF-κB和MAPK途徑,實現(xiàn)細胞毒性、免疫調(diào)節(jié)和細胞凋亡等生物學功能[48]。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn),中藥治療CAG的起效機制與TNF信號通路相關(guān)[49]。

綜上所述,本研究以薏苡仁—浙貝母為研究對象,使用網(wǎng)絡藥理學相關(guān)理論與方法,探討了薏苡仁—浙貝母藥對治療CAG的物質(zhì)基礎、作用靶點及相關(guān)起效機制,并通過分子對接實驗,驗證核心靶蛋白與對應活性成分均有較好結(jié)合能力,預測結(jié)果有一定可靠性。研究方法先進合理,研究結(jié)果體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同起效的獨特優(yōu)勢,為臨床運用薏苡仁—浙貝母治療CAG提供了理論支持,為后續(xù)新藥研發(fā)及推廣臨床應用提供了相對可靠依據(jù)。然而,各平臺數(shù)據(jù)、相應分析算法及軟件功能存在一定局限性,所得結(jié)論還可以通過進一步實驗加以驗證。