王凱 張雪妮 王建華 賈鑫 朱小玲 董玉

缺血性心臟病是指因冠狀動脈狹窄、冠狀動脈痙攣、炎癥等引起心肌組織供血不足、缺血、缺氧甚至壞死而導致的心臟病[1]。缺血性腦卒中是指因為腦部血管破裂或者阻塞導致的血液無法正常流入大腦而對腦組織造成損害的一種腦血管疾病。隨著我國人口的老齡化以及代謝危險因素的持續(xù)流行,缺血性心臟病和缺血性腦卒中對人民的健康和生活造成的壓力和負擔將持續(xù)增加,對我國的疾病防治策略和社會開支以及各種資源的配置也提出了新的挑戰(zhàn)[2]。

蒙藥匝迪-5出自《蒙醫(yī)成方集》,由肉豆蔻、木香、土木香、廣棗和蓽茇組成,在蒙醫(yī)臨床上認為該復方能養(yǎng)心安神、舒心解郁,常用來治療“心赫依病”、心悸、心煩失眠和神昏譫語等。現(xiàn)代藥理學研究表明,該方對心肌缺血再灌注損傷有明確的保護作用,對抑郁癥也有良好的治療作用。課題組前期已經(jīng)對該復方所含有的成分進行了分析,對活性成分進行了初步篩選,對活性成分的作用機制進行了初步探究,并通過實驗驗證了該復方能有效的改善大鼠心肌缺血的狀況,但對該方治療缺血性心臟病的藥效物質(zhì)成分及作用機制尚不明確。另外,有研究證實本方中的一些藥效成分可以通過血腦屏障到達大腦神經(jīng)元細胞?！靶哪X同治”理論起源于傳統(tǒng)中醫(yī)理論體系,現(xiàn)代醫(yī)學對“心腦同治”理論的研究驗證了心腦之間在功能上是相互影響的,且心腦血管疾病之間有共同的病理基礎——動脈硬化[3]。因此,有理由認為本方對缺血性腦卒中也具有一定的治療效果。

網(wǎng)絡藥理學是一門融合系統(tǒng)生物學、信息網(wǎng)絡學、計算機科學和藥理學的綜合學科。網(wǎng)絡藥理學的多成分、多靶點、多通路的分析特點特別適用于傳統(tǒng)醫(yī)藥的作用機制的闡釋。本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討蒙藥匝迪-5與缺血性心臟病及缺血性腦卒中靶點之間的相互作用關系,分析并闡釋蒙藥匝迪-5對缺血性心臟病和缺血性腦卒中進行心腦同治的藥效物質(zhì)基礎及其潛在的藥理作用機制,為匝迪-5治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的臨床用藥提供參考,也為中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的研究提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 匝迪-5活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/)中檢索肉豆蔻、木香、土木香、廣棗、蓽茇,并依據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性指數(shù)(drug likeness,DL)≥0.18 對活性成分進行篩選;考慮到數(shù)據(jù)庫中有效成分的信息可能無法全面的反映藥物所含成分,除了數(shù)據(jù)庫中的活性成分外,課題組還對各味藥材的相關文獻進行了檢索和整理,結(jié)合課題組實驗室前期的體內(nèi)外含量測定結(jié)果,選擇了其中含量較高并且入血的化合物作為活性成分的補充。

1.2 成分靶點篩選

將以上收集的化合物導入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html),以nom fit≥0.7的靶點作為化合物預測靶標;將以上化合物導入 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),以probability≥0.08 為介值進行篩選,獲得化合物靶點。兩個數(shù)據(jù)庫的預測結(jié)果匯總、去重,作為匝迪-5化合物預測靶點做進一步分析。

1.3 疾病靶點的獲取與篩選

以“cerebral ischemia”“ischemic stroke”和“ischemic heart”為關鍵詞分別在Gene Card數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)和TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/)中獲取缺血性腦卒中和缺血性心臟病的疾病相關靶點。將三個數(shù)據(jù)庫靶點匯總、去重,得到疾病的靶點,通過靶點即可構(gòu)建疾病與化學成分甚至各味藥材的聯(lián)系。

1.4 “藥材—化學成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建

將檢索到的匝迪-5活性成分相關靶點與“1.3”項下獲取的兩種疾病靶點取交集,即可獲得匝迪-5同時治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的作用靶點。以從匝迪-5中篩選出來的化合物和“化合物—疾病”的相交潛在靶點為基礎,用Cytoscape 3.7.2軟件建立“藥材—化學成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡圖。

1.5 蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)構(gòu)建

將篩選得到的匝迪-5同時參與缺血性心臟病和缺血性腦卒中的相交潛在靶點上傳至STRING 11.5數(shù)據(jù)平臺(https://cn.string-db.org/),限定物種“homo sapiens”,保留蛋白相互關系≥0.4,得到蛋白與蛋白間的相互作用信息,可得到關鍵靶點。

1.6 GO、KEGG富集分析

將潛在靶點上傳至DAVID平臺(https://david.ncifcrf.gov/),參數(shù)設置為H.sapiens,對靶點進行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genesand genomes,KEGG)通路分析,并使用微生信平臺對GO富集分析和KEGG信號通路富集分析的結(jié)果進行可視化處理,篩選出顯著富集的生物過程和通路信息,以得到藥物靶點的關鍵生物學注釋和藥理作用通路。

1.7 構(gòu)建“活性成分—靶點—通路”網(wǎng)絡

將KEGG通路富集分析得到的通路根據(jù)P-Value值排序,將排名前20的通路及其對應的基因,與匝迪-5心腦同治的活性成分構(gòu)建“活性成分—靶點—通路”網(wǎng)絡圖。

1.8 分子對接核心靶點驗證

分別通過Pub Chem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和AlphaFold蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://alphafold.ebi.ac.uk/)獲取活性成分結(jié)構(gòu)及關鍵蛋白結(jié)構(gòu),運用Auto dock 4.2軟件進行分子對接,根據(jù)結(jié)合能來分析化合物與靶點的結(jié)合模式與親和力,結(jié)果用Py MOL軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 匝迪-5活性成分篩選

通過TCMSP和文獻共篩選出67個化合物(含3個共同化合物),分別是肉豆蔻14個、木香11個、土木香10個、廣棗18個、蓽茇17個?；衔锘拘畔⒁姳?。

表1 匝迪-5活性化合物的相關信息

2.2 疾病靶點的預測

檢索到缺血性心臟病靶點共2243個,缺血性腦卒中靶點共914個。將兩種疾病的靶點與匝迪-5成分靶點構(gòu)建韋恩圖,見圖 1,最終得到三者相交靶點104個。這些靶點為匝迪-5同時干預缺血性心臟病及缺血性腦卒中的潛在作用靶點。

圖1 匝迪-5治療缺血性腦卒中、缺血性心臟病的靶點交集韋恩

2.3 “藥材—化學成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建

將匝迪-5中67種活性成分與104個潛在靶點構(gòu)建“藥材—化學成分—靶點—疾病”網(wǎng)絡,網(wǎng)絡圖有178個節(jié)點數(shù)、1275條邊數(shù),見圖2。節(jié)點大小與度值大小成正比,節(jié)點越大,說明該節(jié)點存在的相互作用關系越多。節(jié)點較大的化學成分有:threo-austrobailignan-5,肉豆蔻木酚素,柚皮素,楊梅素等,見表2,推測這些成分可能是匝迪-5同時干預缺血性心臟病及缺血性腦卒中的核心成分。

注:紫色代表肉豆蔻化合物;黃色代表木香化合物;綠色代表土木香化合物;粉色代表廣棗化合物;橘色代表蓽茇化合物;灰色代表共有化合物;藍色代表疾病與藥物相交靶點;深紅色箭頭代表兩種疾病相同的靶點。

表2 匝迪-5治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的成分中度值前9的活性化合物的相關信息

2.4 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建

將從STRING 11.5下載好的文件導入Cytoscape 3.7.2得到潛在靶點相互作用的網(wǎng)絡,見圖3。PPI網(wǎng)絡圖得到104個節(jié)點,1327條邊。圖中degree值越大顏色越深節(jié)點越大。利用度中心性(degree)篩選蛋白互作網(wǎng)絡中的關鍵靶標。選取degree值前10的靶點作為關鍵靶點,見圖4。推測這些靶點是匝迪-5同時干預缺血性心臟病及缺血性腦卒中的關鍵靶點。其中與抗炎相關的有血清白蛋白(albumin,ALB)靶點、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)靶點;與抗動脈粥樣硬化相關的有ALB靶點;與抗血小板聚集相關的靶點有ALB靶點、一氧化氮合成酶3(nitric oxide synthase3,NOS3)靶點;與抗凋亡相關的靶點有絲/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase1,AKT1)靶點、細胞凋亡易感蛋白(Cellular Apoptosis Susceptibility Protein,CASP)靶點;與細胞增殖或血管新生相關的靶點有血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)靶點、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase3,MAPK3)靶點、NOS3基因;與抗氧化應激相關的靶點有缺氧可誘導因子1(hypoxia inducible factor,HIF-1)A靶點。

注:A 潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖;B 潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。

圖4 關鍵靶點網(wǎng)絡圖

2.5 GO功能富集分析

將104個潛在靶點進行GO功能富集分析。列出分析結(jié)果中-lgP排名前10的功能信息路徑,見圖5。結(jié)果顯示,在生物學過程中,對磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信號的正向調(diào)節(jié)、對缺氧的反應等影響較大;在分子功能層面上,匝迪-5同時治療兩種疾病主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、NADP結(jié)合等;涉及的主要細胞組分有神經(jīng)元細胞體、質(zhì)膜、細胞表面等。

圖5 匝迪-5與缺血性心臟病和缺血性腦卒中相關的靶點GO富集分析

2.6 KEGG生物路徑分析

將104個潛在靶點進行KEGG通路富集分析獲得136條信號通路,將信號通路按照P-value值由小到大排列,前20條信號通路見表3及圖6,其中與癌癥相關的的通路有癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖通路、前列腺癌等;與抗炎相關的通路有MAPK信號通路;與糖尿病相關的信號通路有糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路、糖尿病性心肌病;與動脈硬化相關的信號通路有脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、流體切應力和動脈粥樣硬化信號通路等。

圖6 匝迪-5與缺血性心臟病和缺血性腦卒中相關的靶點KEGG富集分析

表3 匝迪-5與缺血性心臟病和缺血性腦卒中相關的前20條KEGG通路富集分析信息

續(xù)表

2.7 “活性成分—作用靶點—通路”網(wǎng)絡構(gòu)建

匝迪-5活性成分和作用靶點及其相關通路之間的相互作用關系,如圖7所示,表明匝迪-5可通過圖上各條通路之間發(fā)揮協(xié)同作用起到同時干預缺血性心臟病和缺血性腦卒中的作用。

注:紅色代表成分;藍色代表靶點;綠色代表通路。

2.8 利用分子對接進行關鍵靶點驗證

選取PPI網(wǎng)絡中10個關鍵靶點,與度值前9的活性成分進行分子對接,結(jié)果見表4,將得到的結(jié)果繪制成熱圖進行分析,見圖8。研究表明,數(shù)值越小表示結(jié)合能力越強,活性成分越容易與受體結(jié)合?；钚猿煞峙c蛋白結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol表明兩者結(jié)合活性較好,小于-7.0 kcal/mol表明兩者結(jié)合活性強烈。對接結(jié)果顯示,篩選出來的活性成分與部分關鍵蛋白的結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol,表明匝迪-5中的活性成分與關鍵靶點有很好的結(jié)合作用,可能是發(fā)揮藥理作用的關鍵。將結(jié)合能小于-8.0 kcal/mol的分子對接結(jié)果進行可視化處理,見圖9。

注:“-”代表二者沒有相互作用。

圖9 部分蛋白和活性成分分子對接圖

表4 活性成分與關鍵蛋白結(jié)合能(kcal/mol)

3 討論

蒙藥匝迪-5是蒙醫(yī)臨床經(jīng)典名方,現(xiàn)代臨床研究表明,該方可用于治療多種精神方面的疾病和心血管疾病如抑郁癥、失眠、冠脈綜合征、心律失常等。蒙醫(yī)理論認為,心為具有主意識、司血行功能的臟器,居于赫依之位,是病變赫依的竄行之道,匝迪-5可以有效的祛“心赫依”病。在中醫(yī)理論體系當中,則認為“心為藏神之臟”“腦為元神之府”,神藏于心出于腦,心腦相通,主張“心腦同治”。心腦同治理論體現(xiàn)了中醫(yī)理論的整體觀念和異病同治的原則。現(xiàn)代醫(yī)學研究認為,心與腦通過“心腦軸”[24]和“腦心軸”[25]實現(xiàn)相互作用,且心腦血管疾病的病理學基礎均為動脈硬化,于心則會造成心肌缺血,于腦則會造成腦部缺血。基于以上理論,我們推測對缺血性心臟病有著良好的治療效果的蒙藥匝迪-5或許對缺血性腦卒中也具有一定的治療作用。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析方法對匝迪-5治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的作用機制進行闡釋,對其中的活性成分進行篩選,得到作用靶點較多的活性成分有柚皮素、楊梅素、蓽茇寧酰胺等。分子對接的結(jié)果顯示,這些篩選出的活性成分均與關鍵靶點有較好的結(jié)合能力,并且我們還發(fā)現(xiàn)其中的黃酮類化合物與關鍵靶點的結(jié)合能普遍低于匝迪-5中的其他組分,研究也表明黃酮類化合物可以通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等功效起到抗心腦血管缺血性疾病的作用,這提示我們其中的黃酮類化合物可能是治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的關鍵成分群。匝迪-5的活性成分中,柚皮素可抑制MAPK信號通路,降低Cacpase-3、Bax蛋白表達,減輕心肌細胞凋亡;促進VEGF mRNA的表達來促進血管新生;降低體內(nèi)人白細胞介素(Interleukin,IL)-1β和TNF-α水平,起到抗炎的作用,以減輕缺血缺氧性損傷;還能緩解缺氧損傷造成的心肌細胞的肥大狀況,抑制脂質(zhì)過氧化[6]。楊梅素可以通過調(diào)節(jié)血紅素氧合酶-1(hemeoxyenase-1, HO-1)的表達起到抗氧化的作用;通過抑制血小板的聚集來干擾血栓的形成;還可以降低IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達,達到抗炎的效果[27-29]。肉豆蔻木酚素可以通過抑制炎癥反應,保護神經(jīng)元,減少腦缺血帶來的損傷;另外,肉豆蔻木酚素的抗氧化活性對治療心腦血管病也有重要作用[30]。除此之外,存在一些尚未被報道的有效成分可能為匝迪-5干預缺血性心臟病和腦缺血的主要有效成分,如threo-austrobailignan-5、bis[(2S)-2-ethylhexyl] benzene-1,2-dicarboxylate等,預測這些有效成分的功效將成為未來研究匝迪-5干預缺血性心臟病和腦缺血的潛在方向,其藥效學及作用機制有待進一步驗證。

研究表明,缺血性心臟病和缺血性腦卒中發(fā)生的病理機制類似,均與氧化性損傷、血小板凝集、細胞凋亡、炎癥反應等息息相關。網(wǎng)絡藥理學GO富集分析結(jié)果表明,匝迪-5可以通過作用于ALB靶點起到抗血栓的作用[31];通過作用于TNF靶點抑制炎癥因子的產(chǎn)生[32];通過CASP3靶點[33-34]和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (Matrix metalloproteinase-9,MMP9)靶點[35]減弱心肌細胞和神經(jīng)細胞的細胞凋亡;AKT-1靶點[36-37]和表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)靶點[35]則與細胞的代謝、增殖和生長密切相關,在心腦細胞梗死后的保護中發(fā)揮重要作用;VEGFA靶點缺氧條件下可促進細胞增殖和血管生成,VEGFA靶點還可以通過上調(diào)腦缺血區(qū)血管性血友病因子水平,促進血液循環(huán),改善神經(jīng)功能缺損的癥狀[35,38]。KEGG富集分析結(jié)果顯示,匝迪-5對缺血性心臟病和缺血性腦卒中的治療和保護效果主要是通過抗血栓,促進血管新生和抗凋亡,抗動脈粥樣硬化等實現(xiàn),且與癌癥及糖尿病相關通路聯(lián)系密切。癌癥與心腦血管疾病聯(lián)系密切,有研究表明,癌癥可通過激活凝血因子、改變患者的凝血狀態(tài),引起血液高凝狀態(tài),形成微血栓,進而導致心肌缺血和缺血性腦卒中的發(fā)生[39]。心腦血管疾病的發(fā)生與糖代謝異常之間關系密切,當血液中的血糖和游離脂肪酸異常時,會導致血管壁內(nèi)皮細胞功能障礙,促進炎癥反應與血栓的形成。如晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product,AGE)會激活其受體RAGE引發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應,使細胞纖維化,導致心臟和血管的炎癥和氧化應激的發(fā)生。本研究的KEGG通路的映射結(jié)果顯示,匝迪-5的通路富集結(jié)果中出現(xiàn)了多個癌癥和糖尿病相關通路,表明匝迪-5對于治療伴有癌癥或糖尿病或者與其相關的病理因素導致的心肌缺血和腦缺血有良好的效果。MAPK信號通路是本研究富集到的重要通路之一,既往的研究表明,MAPK信號通路與缺血性腦卒中發(fā)生后炎性細胞因子和細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄等多種細胞進程息息相關,同時有研究表明,該信號通路可以調(diào)節(jié)血小板活化和凋亡,在血栓的形成過程中發(fā)揮著關鍵的作用[35]。AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路則均與血管的新生密切相關[40-41]。Ras相關蛋白1(Ras-related protein 1,Rap1)信號通路可以對血小板整合素的激活和血小板的生成發(fā)揮重要作用。HIF-1信號通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應激信號通路,在缺血缺氧、炎性因子刺激下,HIF-1通路可以調(diào)控缺氧適應,其轉(zhuǎn)錄的VEGF及EGF,可調(diào)節(jié)下游VEGF信號通路與叉頭盒O(Forkhead Box O,FoxO)信號通路,參與血管平滑肌細胞增殖和遷移、抗氧化應激、NO合成等生物過程[42]。網(wǎng)絡藥理學的分析結(jié)果表明,匝迪-5主要通過活化血小板、抗血栓、抗炎抗凋亡、促進血管新生來達到對缺血性心臟病和缺血性腦卒中的治療和保護效果,對伴有癌癥或糖尿病的患者該方也具有一定治療效果。

本文基于“心腦同治”的理論思想,運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術對蒙藥匝迪-5治療缺血性心臟病和缺血性腦卒中的作用機制進行了探究,對其中的活性成分、作用靶點及作用的信號通路進行了分析預測,為后續(xù)的活性成分篩選、作用機制的闡釋和該方用于缺血性腦卒中的動物實驗及臨床應用和新藥開發(fā)提供了思路和依據(jù)。但本文僅是從數(shù)據(jù)庫及論文信息進行了“藥材-成分-靶點-通路”的理論分析,沒有分析成分的量效關系,沒有分析化學成分群的總體作用,沒有分析腸道菌群對成分的介導作用等,因此所得的結(jié)論仍需要通過進一步的實驗加以驗證討論。