胡藍(lán)爍 楊先照 王建云 江海燕 劉果 劉元 張?chǎng)?思瓔桀 王新月

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的慢性非特異性結(jié)直腸炎癥性疾病。目前認(rèn)為,腸道微環(huán)境改變后產(chǎn)生持續(xù)異常的免疫反應(yīng)可能是導(dǎo)致UC發(fā)生和發(fā)展的重要原因[1]。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的腸道微環(huán)境改變主要表現(xiàn)為腸道菌群種類(lèi)、數(shù)量、比例、定位及生物學(xué)特性上的變化,通過(guò)干預(yù)腸道內(nèi)的菌群可以對(duì)UC起到治療作用[2]。解毒活血方為筆者團(tuán)隊(duì)灌腸治療UC的臨床驗(yàn)方,亦是北中醫(yī)三院脾胃病科的協(xié)定處方,在減輕UC癥狀、長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)緩解、減少?gòu)?fù)發(fā)方面具有良好的臨床療效[3-4]。以往實(shí)驗(yàn)研究表明,解毒活血方灌腸能夠下調(diào)與腸道微生物識(shí)別、免疫反應(yīng)密切相關(guān)的Toll樣受體4信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),調(diào)整促炎因子與抗炎因子水平[5]。在前期研究的基礎(chǔ)上,本課題組繼續(xù)以葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)建立的UC小鼠模型為研究對(duì)象,延長(zhǎng)給藥及觀察時(shí)間,觀察解毒活血方灌腸對(duì)小鼠腸道微生態(tài)的物種、豐度、多樣性及代謝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠,SPF級(jí),7周齡,雄性,體質(zhì)量(21.2±1.5)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2019-0010。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京永欣康泰科技發(fā)展有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):YXKT2022L008)。動(dòng)物在溫度(25±2)℃,濕度45%、12小時(shí)光照實(shí)驗(yàn)環(huán)境下自由飲水和進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

本實(shí)驗(yàn)使用解毒活血方(黃連10 g、黃柏10 g、苦參10 g、五倍子10 g、三七3 g、白及3 g)購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):黃連配方顆粒20039981,黃柏配方顆粒21028681,苦參配方顆粒21021431,五倍子21007911,三七配方顆粒21019521,白及配方顆粒21007453)。藥物加蒸餾水充分混勻后,按照60 kg成人和20 g小鼠等效劑量換算比例1∶10,濃縮成含生藥6.12 g/mL的灌腸液,滅菌分裝后于4℃冰箱保存。美沙拉秦灌腸液(德國(guó)Dr.Falk Pharma GmbH公司生產(chǎn),規(guī)格:4 g/支,批號(hào):H20150127)。

1.3 主要試劑與儀器

DSS(美國(guó)MP Biomedicals公司生產(chǎn),規(guī)格:100 g/瓶,批號(hào):0216011080);OMEGA-soil DNA抽提試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司生產(chǎn),批號(hào):D5265-01);2%瓊脂糖凝膠(西班牙Bioweste公司生產(chǎn),規(guī)格:100 g/瓶,批號(hào):111860);FastPfu Polymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號(hào):M20105);AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國(guó)Axygen公司生產(chǎn),批號(hào):RH185765);TruSeqTMDNA Sample Prep Kit(美國(guó)Illumina公司生產(chǎn),批號(hào):15055162);NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒(美國(guó)Bioo Scientific公司生產(chǎn),批號(hào):5144-01);MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒(美國(guó)Illumina公司生產(chǎn),批號(hào):15055256)。

移液器(德國(guó)Eppendorf公司,型號(hào):Eppendorf N13462C);微型離心機(jī)(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):ABSON MiFly-6);小型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司,型號(hào):Eppendorf 5430 R);超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):NanoDrop2000);電泳儀(北京市六一儀器廠,型號(hào):DYY-6C);PCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào):ABI GeneAmp?9700);MISEQ測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司,型號(hào):Illumina Miseq);旋渦混合器(海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司,型號(hào):QL-901);粉碎研磨儀(上海萬(wàn)柏生物科技有限公司,型號(hào):TL-48R)。

1.4 分組給藥與組織取材

80只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組,每組20只。各組小鼠均予SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)。模型組、西藥組、中藥組小鼠自由飲用蒸餾水配置的3% DSS溶液,連續(xù)7天,制備 UC小鼠模型[5]。小鼠逐漸出現(xiàn)大便次數(shù)增多伴膿血、體質(zhì)量下降、進(jìn)食減少等表現(xiàn),造模7天后各組動(dòng)物隨機(jī)選取2只驗(yàn)證造模成功。造模成功后,各組動(dòng)物給予灌腸處理,每日1次,連續(xù)14天。根據(jù)小鼠體重?fù)Q算灌腸劑量為0.02 mL/g,中藥組按12.2 g/kg予解毒活血方混懸液灌腸,西藥組按1.33 g/kg給予美沙拉秦灌腸劑灌腸,模型組及正常組給予相同體積的生理鹽水灌腸。

給藥14天后,經(jīng)水合氯醛麻醉后在無(wú)菌操作臺(tái)上打開(kāi)小鼠腹腔,剖取肛門(mén)至盲腸末端的整個(gè)結(jié)腸組織,于吸水紙上展開(kāi)并測(cè)量長(zhǎng)度,沿腸系膜縱向剪開(kāi),取結(jié)腸中的小鼠糞便置于無(wú)菌管內(nèi)放置-80℃冰箱內(nèi)凍存,結(jié)腸組織經(jīng)0.9%氯化鈉注射液清洗后放置4%多聚甲醛溶液中固定備用。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 一般情況觀察及疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI) 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察并記錄各組小鼠體質(zhì)量、飲食飲水量,觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛色光澤程度及排便次數(shù)、大便性狀、便血情況。小鼠體重下降百分比:不變?yōu)?分,下降1%～5%為1分,5%～10%為2分,10%～15%為3分,大于15%為4分。大便性狀:正常為0分,軟但成形為1分,未成形便為2分,半成型和稀便之間為3分,稀便為4分。血便:潛血陰性為0分,潛血陽(yáng)性為1分,便中帶血為2分,便中帶血和血便之間為3分,血便為4分。小鼠體質(zhì)量、大便性狀和便血情況評(píng)分總和為DAI。

1.5.2 結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)量及黏膜損傷指數(shù)(colonic mucosa damage index,CMDI)評(píng)分 測(cè)量從小鼠肛門(mén)至盲腸的結(jié)腸長(zhǎng)度,縱向剪開(kāi)結(jié)腸后用放大鏡觀察結(jié)腸黏膜形態(tài),進(jìn)行黏膜損傷指數(shù)評(píng)分[6],黏膜損傷指標(biāo)包括粘連(0分:無(wú)粘連;1分:結(jié)腸與周?chē)M織輕度粘連,易剝離;2分:結(jié)腸與周?chē)M織重度粘連,剝離困難),潰瘍形成及炎癥(0分:無(wú)潰瘍及炎癥;1分:局部充血,無(wú)潰瘍;2分:1處潰瘍不伴腸壁充血或增厚;3分:1處潰瘍伴炎癥;4分:≥2處潰瘍伴炎癥;5分:≥2處潰瘍和/或炎癥>1 cm;6～8分:潰瘍和/或炎癥≥2 cm,病變范圍每增加1 cm,計(jì)分加1),腺瘤樣占位(0分:無(wú)腺瘤;1分:1處腺瘤;2分:≥2處),計(jì)算各項(xiàng)總和。

1.5.3 結(jié)腸組織學(xué)損傷指數(shù)(colon histopathological score,CHS)評(píng)分 將固定48小時(shí)的結(jié)腸組織按照脫水、包埋、切片(厚度4 μm)、常規(guī)HE染色的順序制作病理切片,光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理改變,并進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分,組織學(xué)指標(biāo)包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、纖維化及病變深度,其中炎癥、纖維化按有無(wú)及輕重,潰瘍按無(wú)、潰瘍<3 mm、潰瘍≥3 mm分別計(jì) 0、1、2 分,病變深度按無(wú)及達(dá)黏膜下層、肌層、漿膜層分別計(jì)0、1、2、3 分,各項(xiàng)相加得總分[7]。

1.5.4 小鼠腸道菌群的16S rRNA測(cè)序 (1)DNA抽提和PCR擴(kuò)增:采用Omega soil試劑盒從凍存的小鼠糞便中提取DNA,使用NanoDrop 2000檢測(cè)DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。以338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 為引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3分鐘,27個(gè)循環(huán)(95℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒),最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增體系為20 μL,包括4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mM dNTPs,0.8 μL引物(5 μM),0.4 μL FastPfu 聚合酶,10 ng DNA模板。(2)文庫(kù)構(gòu)建和Illumina Miseq 測(cè)序:使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè),利用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)步驟:連接“Y”字形接頭,使用磁珠篩選去除接頭自連片段,PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集,氫氧化鈉變性后產(chǎn)生單鏈DNA片段,利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5.5 小鼠腸道菌群差異分析 用Qiime tools import插件,將測(cè)序所得的原始序列fastq文件,導(dǎo)入為可進(jìn)行QIIME2后續(xù)處理的文件格式。運(yùn)用QIIME2 dada2插件進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接,并去除嵌合體后,得到最終的特征序列表格[8]。使用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對(duì)到預(yù)先訓(xùn)練好的13_8版本99%相似度的GREENGENES數(shù)據(jù)庫(kù)(根據(jù)338F/806R引物對(duì)將數(shù)據(jù)庫(kù)修剪到V3V4的區(qū)域),得到物種分類(lèi)信息表[9],用QIIME2 feature-table插件剔除所有污染性的線粒體和葉綠體序列,完成各組小鼠腸道菌群的數(shù)據(jù)質(zhì)控和物種注釋。

1.5.6 小鼠腸道菌群多樣性分析 使用QIIME2 core-diversity插件計(jì)算多樣性矩陣,采用特征序列水平Alpha多樣性指數(shù)中observed OTUs、Chao1指數(shù)來(lái)評(píng)估小鼠腸道菌群物種組成的豐富度和均勻度。同時(shí)應(yīng)用R軟件包“mixOmics”,偏最小二乘判別分析(PLS-DA)計(jì)算Beta多樣性指數(shù),包括Bray Curtis、unweighted UniFrac、weighted UniFrac指數(shù)),評(píng)估包括優(yōu)勢(shì)菌群及稀有菌群在內(nèi)的各組小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)間的差異性[10]。

1.5.7 小鼠腸道菌群代謝功能預(yù)測(cè)分析 采用PICRUSt軟件對(duì)小鼠腸道微生物群體可能的功能組成進(jìn)行推斷,構(gòu)建微生物全譜系的基因功能預(yù)測(cè)譜[11],并通過(guò)KEGG、MetaCyc和EC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)功能基因進(jìn)行注釋,對(duì)各組小鼠腸道微生物代謝功能進(jìn)行注釋。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠排便與體質(zhì)量變化

造模后各組小鼠均出現(xiàn)大便次數(shù)增多、便質(zhì)不成形、大便帶血等排便異常,同時(shí)伴有活動(dòng)量及進(jìn)食減少、體重減輕、體毛脫落。經(jīng)過(guò)14天治療后,西藥組、中藥組血便減少,大便逐漸成形,進(jìn)食量增加,精神狀態(tài)改善,體重較前恢復(fù)。對(duì)照組小鼠大便性狀及排便次數(shù)同前,進(jìn)食量及體重繼續(xù)下降。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,造模期間各組小鼠無(wú)死亡,治療期間中藥組灌腸死亡1只。

2.2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、DAI、CMDI、CHS評(píng)分

與正常組比較,模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短(P<0.05),DAI、CMDI、CHS評(píng)分升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組及西藥組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度增加(P<0.05)、DAI降低(P<0.01),中藥組CMDI、CHS評(píng)分降低(P<0.05);與西藥組比較,中藥組DAI、CMDI評(píng)分降低(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、DAI、CMDI、CHS比較

2.3 結(jié)腸組織病理組織學(xué)改變

正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)潰瘍及壞死,結(jié)腸黏膜上皮完整,可見(jiàn)明顯的隱窩和大量杯狀細(xì)胞。模型組小鼠黏膜層完整性受損,潰瘍突破黏膜肌層,可見(jiàn)隱窩萎縮和杯狀細(xì)胞大量減少,黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥組小鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)散在淺潰瘍,仍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)隱窩膿腫。中藥組小鼠可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞,結(jié)腸黏膜及黏膜下層少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩結(jié)構(gòu)恢復(fù)。見(jiàn)圖1。

注: A 正常組;B 模型組;C 西藥組;D 中藥組。

2.4 各組小鼠腸道菌群門(mén)屬水平主要物種相對(duì)豐度比較

經(jīng)16S rRNA技術(shù)測(cè)序后共得到9628個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units, OTU),包括11個(gè)門(mén),109個(gè)屬。在門(mén)水平,厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群(總體豐度分別為49.23%、34.90%),其次為疣微菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)。在屬水平,總體豐度大于10%的優(yōu)勢(shì)菌群依次為擬桿菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬、Turicibacte菌屬、Allobaculum菌屬、AKK菌屬(總體豐度依次為19.2%、16.6%、12.2%、11.6%、10.4%、10.2%),見(jiàn)表2。其中,正常組優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬及AKK菌屬;模型組擬桿菌屬、梭菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群,與正常組比較,豐度升高(P<0.05,P<0.01);西藥組擬桿菌屬及Allobaculum菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群,與模型組比較,豐度升高(P<0.05);中藥組以擬桿菌屬、梭菌屬、Turicibacter、Allobaculum菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群,與西藥組比較,擬桿菌屬豐度降低(P<0.05),Allobaculum、Turicibacter菌屬豐度升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠腸道菌群門(mén)水平主要物種相對(duì)豐度比較

表3 各組小鼠腸道菌群屬水平主要物種相對(duì)豐度比較

2.5 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較

對(duì)各組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度均>1%者進(jìn)行組間差異性分析。與正常組比較,模型組Allobaculum菌OTU升高(P<0.05),Turicibacter菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、Mucispirillum菌、消化鏈球菌、薩特氏菌、腸球菌OTU升高(P<0.01);AKK菌、Arthromitus菌、乳桿菌OTU降低(P<0.01)。與模型組比較,西藥組雙歧桿菌、AKK菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),腸球菌OTU降低(P<0.05),梭狀芽孢桿菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.01);中藥組Turicibacter菌OTU升高(P<0.05),雙歧桿菌、AKK菌、Allobaculum菌OTU升高(P<0.01),乳桿菌、梭狀芽孢桿菌、Mucispirillum菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.01),腸球菌OTU降低(P<0.05)。與西藥組比較,中藥組雙歧桿菌、Turicibacter菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),乳桿菌、Mucispirillum菌OTU降低(P<0.01),消化鏈球菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.05)。見(jiàn)表4～5,圖2。

注:cladogram圖由內(nèi)到外,對(duì)應(yīng)界門(mén)綱目科屬不同的分類(lèi)層級(jí),層級(jí)間連線代表所屬關(guān)系。每個(gè)圓圈節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)物種,節(jié)點(diǎn)為黃色代表在分組間差異不顯著,不為黃色則代表該物種是對(duì)應(yīng)顏色分組的特征微生物(在該分組豐度顯著較高)。有顏色的扇形區(qū)域?yàn)樘卣魑⑸锏南聦俜诸?lèi)區(qū)間。

表4 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較個(gè))

表5 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較個(gè))

2.6 各組小鼠腸道菌群多樣性比較

與正常組比較,Alpha多樣性指數(shù)Observed OTUs、Chao1下降(P<0.05),Beta多樣性距離Bray Curtis、Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac縮小(P<0.01);與模型組比較,中藥組Bray Curtis增大(P<0.01),Observed OTUs、Chao1升高(P<0.05),西藥組Bray Curtis、Unweighted Unifrac增大(P<0.05);與西藥組比較,Chao1、Bray Curtis增大(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠腸道菌群Alpha及Beta多樣性差異比較

2.7 各組小鼠微生物群落代謝功能預(yù)測(cè)比較

與正常組比較,模型組碳水化合物代謝降低(P<0.05),AMPK信號(hào)通路表達(dá)、脂類(lèi)、萜類(lèi)、聚酮代謝降低(P<0.01),氨基酸、維生素、輔酶代謝、多糖生物合成與代謝升高(P<0.01)。與模型組比較,西藥組AMPK通路表達(dá)、碳水化合物、多糖生物合成與代謝升高(P<0.05),萜類(lèi)、聚酮代謝降低(P<0.05);中藥組AMPK通路表達(dá)、碳水化合物代謝升高(P<0.05),脂類(lèi)、萜類(lèi)、聚酮代謝升高(P<0.01),氨基酸、維生素、輔酶代謝、多糖生物合成與代謝降低(P<0.05)。與西藥組比較,中藥組脂類(lèi)、萜類(lèi)、聚酮代謝升高(P<0.01),維生素、輔酶代謝降低(P<0.05),多糖生物合成與代謝降低(P<0.01),見(jiàn)表7。

表7 各組小鼠腸道微生物群落代謝功能預(yù)測(cè)比較

3 討論

鑒于UC具有遷延難愈,邪氣較甚,深伏難解的特點(diǎn),結(jié)合中醫(yī)毒邪學(xué)說(shuō)與絡(luò)病學(xué)說(shuō),針對(duì)“毒邪深伏、絡(luò)病難愈”的特征[15],課題組認(rèn)為UC存在毒邪內(nèi)聚,蘊(yùn)結(jié)腸腑,入血入絡(luò)的微觀病機(jī)[16]。邪氣蘊(yùn)結(jié)不解謂之毒,UC易感個(gè)體因先天稟賦差異,加之外感六淫、飲食不節(jié)、情緒失調(diào)、過(guò)度勞累等因素,導(dǎo)致脾胃功能失常,水濕滯留腸間,久羈不去,化生濕熱。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確,但腸道微生態(tài)菌群與結(jié)腸炎癥的相關(guān)性問(wèn)題已成為業(yè)界專(zhuān)家關(guān)注的焦點(diǎn)。已有研究證實(shí),腸道微生物在維持宿主黏膜屏障結(jié)構(gòu)的完整、營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)及對(duì)病原體的防御等方面均具有重要作用。腸道微生物種群的多樣性、空間或數(shù)量發(fā)生改變,益生菌數(shù)量減少、病原菌過(guò)度生長(zhǎng)等腸道菌群失調(diào)可能是導(dǎo)致UC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。腸道內(nèi)益生菌減少,條件致病菌增多,并由此引發(fā)炎癥反應(yīng)及代謝障礙可以視作毒邪化生的表現(xiàn)。

目前研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌、Turicibacter菌、AKK菌、Arthromitus菌、雙歧桿菌為常見(jiàn)的腸道益生菌,在構(gòu)建宿主腸道屏障、維持腸道菌群生態(tài)平衡、阻止致病菌對(duì)腸道的入侵和定植、控制內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、提高營(yíng)養(yǎng)利用度上均具有重要作用[17-21]。擬桿菌、梭菌、消化鏈球菌、腸球菌為人與鼠腸道的基石菌群,能夠吸收和降解膳食中人體不能夠降解的多種植物多糖,參與脂肪代謝,調(diào)節(jié)細(xì)菌毒素的產(chǎn)生并增強(qiáng)宿主固有的免疫反應(yīng)等,但同時(shí)也是機(jī)會(huì)致病菌,可以產(chǎn)生毒素,引起炎癥,誘發(fā)或加重感染[21-24],其中薩特氏菌、Allobaculum菌、Mucispirillum菌對(duì)腸道炎癥有促進(jìn)作用[25-27]。腸道微生物還可以通過(guò)發(fā)酵不能被宿主小腸吸收利用的食物殘?jiān)蜕掀ぜ?xì)胞分泌的內(nèi)生黏液來(lái)發(fā)揮代謝作用[28]。一方面,腸道內(nèi)微生物可將各種多糖、寡糖,代謝為短鏈脂肪酸,為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量來(lái)源,還能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝,降低血糖與血脂[29]。另一方面,腸道內(nèi)微生物在厭氧的條件下也能代謝肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸,但同時(shí)會(huì)生成如氨、胺、苯酚、吲哚等有害物質(zhì),即腐敗作用[30]。此外,腸道細(xì)菌還參與了多種維生素的合成以及鈣、鎂、鐵等離子的吸收,參加萜類(lèi)及聚酮代謝,發(fā)揮抗炎、抑菌及維持細(xì)胞穩(wěn)定的作用[31]。

本研究中,UC模型小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)升高、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短,結(jié)腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分均反映了小鼠的結(jié)腸炎癥情況。經(jīng)藥物干預(yù)后,美沙拉秦及解毒活血方灌腸均有有效減輕小鼠結(jié)腸炎癥,解毒活血方治療作用更為顯著。腸道菌群失調(diào)可能是UC的發(fā)病機(jī)制之一,本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA技術(shù)對(duì)UC小鼠腸道菌群進(jìn)行分類(lèi)測(cè)序后發(fā)現(xiàn),各組小鼠均以厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群,與既往研究結(jié)果一致[32]。在屬水平,模型組小鼠腸道中的益生菌Arthromitus菌減少,而梭菌屬、消化鏈球菌屬、薩特氏菌屬、腸球菌等機(jī)會(huì)致病菌屬增多,增加了結(jié)腸炎癥發(fā)生的幾率;西藥組及中藥組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌屬增多,梭狀芽孢桿菌、腸球菌屬、薩特氏菌屬等機(jī)會(huì)致病菌減少;中藥組小鼠腸道菌群中益生菌的增多及機(jī)會(huì)致病菌的減少優(yōu)于西藥組。其次在物種組成的多樣性上,模型組小鼠物種組成的豐富度和均勻度指數(shù)均下降,優(yōu)勢(shì)物種與稀有物種的多樣性差異距離均縮小,經(jīng)中藥干預(yù)后,小鼠腸道菌群物種組成的豐富度和均勻度指數(shù)均回升,優(yōu)勢(shì)物種與稀有物種的多樣性差異距離均恢復(fù)。在各組小鼠代謝功能預(yù)測(cè)中,模型組小鼠無(wú)論是與能量相關(guān)的AMPK信號(hào)通路表達(dá)、還是碳水化合物、脂類(lèi)、萜類(lèi)、聚酮代謝、共棲生物合成與代謝均較空白小鼠降低,但與腐敗相關(guān)的氨基酸代謝升高。與模型組比較,西藥組、中藥組小鼠AMPK通路表達(dá)、碳水化合物、萜類(lèi)、聚酮代謝升高,且中藥組脂類(lèi)代謝高于西藥組,氨基酸代謝低于模型組。說(shuō)明中藥在恢復(fù)碳水化合物、脂類(lèi)等對(duì)身體有益的代謝功能上療效均優(yōu)于西藥組。

綜上,經(jīng)DSS造模后,模型組小鼠除疾病活動(dòng)指數(shù)升高、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、黏膜炎性損傷外,還出現(xiàn)益生菌種群減少,條件致病菌數(shù)量增加,物種多樣性及差異性下降,能量代謝降低,腐敗作用增加,這些變化可能是UC毒邪化生的機(jī)制之一,解毒活血方灌腸能提高小鼠菌群的物種豐度,促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng),抑制機(jī)會(huì)性致病菌或有害菌的定殖,提高腸道優(yōu)勢(shì)菌群及稀有菌群的多樣性,改善微生物群落的代謝功能,維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài),這可能是解毒活血方減輕DSS造模UC小鼠結(jié)腸炎癥的作用機(jī)制。但實(shí)驗(yàn)總體觀察時(shí)間較短,中藥組小鼠腸道菌群同正常組小鼠仍有較大差異,仍需通過(guò)制備慢性UC模型、延長(zhǎng)觀察時(shí)間來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證解毒活血方抗炎、抗復(fù)發(fā)的機(jī)制。