吳疆，趙斌，陳嘯，趙謙，駱巍，任富繼，黃競(jìng)敏

（天津市天津醫(yī)院運(yùn)動(dòng)損傷與關(guān)節(jié)鏡二病區(qū)，天津 300211）

隨著中國(guó)老齡化進(jìn)程的加劇，膝骨關(guān)節(jié)炎正成為中老年人群中常見(jiàn)的退行性疾病之一，給患者造成了嚴(yán)重的身心痛苦并加重了社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。膝骨關(guān)節(jié)炎通常會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的磨損，因此對(duì)膝關(guān)節(jié)功能造成嚴(yán)重?fù)p傷[2]。膝蓋部位的關(guān)節(jié)炎通常只累及一側(cè)，累及側(cè)往往由于長(zhǎng)期受到較大負(fù)荷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)對(duì)合不良[3]。在股骨和脛骨內(nèi)側(cè)部位，關(guān)節(jié)對(duì)合不良和縱向軟骨丟失均具有明顯的關(guān)聯(lián)[4]。

目前，國(guó)際上廣泛采用脛骨高位截骨術(shù)（HTO）治療膝骨關(guān)節(jié)炎合并膝內(nèi)翻，并取得了較好的臨床療效。截骨術(shù)能夠有效降低內(nèi)側(cè)間室壓力以及疼痛，并且能夠延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展及需要進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的時(shí)間[5-6]。HTO 可以通過(guò)修正脛骨，降低患者膝蓋內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的受力程度，改變患者下肢的負(fù)重軸線，從而減輕受累側(cè)的負(fù)荷[7]。Jung等[8]發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)開(kāi)放楔形脛骨高位截骨術(shù)糾正膝內(nèi)翻之后，即使不采取軟骨再生手段，經(jīng)過(guò)兩年左右時(shí)間，股骨內(nèi)髁和脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)中退化的軟骨仍能夠部分覆蓋有新生軟骨。

研究表明，關(guān)節(jié)鏡聯(lián)合HTO 能夠促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨再生[9-10]，然而介導(dǎo)此現(xiàn)象的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)等生理過(guò)程密切相關(guān)，參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的整個(gè)過(guò)程[11-13]。因此，深入研究ERK 信號(hào)通路在關(guān)節(jié)鏡聯(lián)合HTO 治療骨關(guān)節(jié)炎疾病中的作用機(jī)制具有重大意義。本研究對(duì)內(nèi)側(cè)間室骨性關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡聯(lián)合HTO 手術(shù)治療，術(shù)后1 年，在對(duì)上述患者取內(nèi)固定的同時(shí)再次進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡檢查，觀察術(shù)后1 年膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室軟骨再生情況；同時(shí)取部分新生軟骨進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)，研究成果有望為骨關(guān)節(jié)炎臨床治療提供新的思路和方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究共納入天津市天津醫(yī)院關(guān)節(jié)鏡科2020 年8 月—2021 年8 月50 例患者。其中男11 例，女39 例。患者平均年齡為（56.0±3.4）歲（54～63 歲），平均體重指數(shù)（23.4±3.8）kg/m2（19.6～33.0 kg/m2）。其中包含9 例左膝骨性關(guān)節(jié)炎以及11例右膝骨性關(guān)節(jié)炎。所有患者均為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎合并膝內(nèi)翻，且分級(jí)低于Ahlback Ⅱ級(jí)，術(shù)前膝內(nèi)翻角平均為192.6°±3.8°（189°～198°）。所有患者均無(wú)明顯關(guān)節(jié)不穩(wěn)，可以進(jìn)行正常程度的運(yùn)動(dòng)。對(duì)患者進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)聯(lián)合HTO。術(shù)前規(guī)劃、手術(shù)方案以及術(shù)后康復(fù)訓(xùn)練按照已發(fā)表的文獻(xiàn)實(shí)施[14-16]?；颊咝g(shù)后傷口恢復(fù)均良好，且1 年內(nèi)無(wú)感染、骨愈合不良、或指甲板斷裂等并發(fā)癥出現(xiàn)。所有患者在進(jìn)行鋼板或螺絲移除時(shí)接受二次關(guān)節(jié)鏡檢查。納入患者均知情同意且該研究通過(guò)天津市天津醫(yī)院倫理審查，倫理編號(hào)：2020 醫(yī)倫理085。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）膝關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)受限，但日常生活均能獨(dú)立完成。（2）參加本項(xiàng)研究前2 周未曾服用過(guò)消炎鎮(zhèn)痛藥物。（3）無(wú)明顯外傷史。（4）影像資料顯示單純膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室骨性關(guān)節(jié)炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）1 年內(nèi)接受過(guò)正規(guī)的臨床治療。（2）1 年內(nèi)有過(guò)膝關(guān)節(jié)手術(shù)史。（3）半年內(nèi)進(jìn)行過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療。（4）存在全身其他關(guān)節(jié)疾病。（5）存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病（癲癇等）。（6）存在前庭器官疾病和嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)節(jié)鏡評(píng)估 術(shù)前對(duì)脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)和股骨髁關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡觀察，術(shù)后1 年進(jìn)行再次觀察。采取國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)軟骨損傷分級(jí)系統(tǒng)（ICRS）對(duì)軟骨再生進(jìn)行評(píng)分[17]。標(biāo)準(zhǔn)如下：1 級(jí)為可見(jiàn)表面細(xì)紋或裂縫，或淺表病變；2 級(jí)為病變不超過(guò)軟骨厚度的50%；3 級(jí)為病變超過(guò)軟骨厚度的50%，但是不累及軟骨下骨；4 級(jí)為病變累及軟骨下骨。

患者在移除鋼板或螺絲時(shí)進(jìn)行二次關(guān)節(jié)鏡檢查，對(duì)脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)和股骨髁關(guān)節(jié)進(jìn)行再生評(píng)分[18-19]。標(biāo)準(zhǔn)如下：1 級(jí)為無(wú)再生；2 級(jí)為具有白色分散的纖維軟骨，或者纖維軟骨的局部或均勻覆蓋。

1.2.2 病理學(xué)檢測(cè) 在患者進(jìn)行二次關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)，采集新生骨組織進(jìn)行病理學(xué)分析。用于病理分析的樣本，將組織進(jìn)行固定、脫水并用石蠟包埋后，進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)、番紅O 固綠染色。此外，對(duì)樣本進(jìn)行Ⅱ型膠原的免疫組化染色以確認(rèn)新生組織為軟骨樣組織。

1.2.3 qRT-PCR 采用正常軟骨作為對(duì)照組（A）；術(shù)后新生組織作為實(shí)驗(yàn)組（B）。采用Trizol 法提取所獲得的軟骨樣組織總RNA，使用ReverTra Ace qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。待檢測(cè)靶分子引物序列如下：β-actin：F5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，R5′-GGCGGCAC CACCATGTACCCT-3′；Collagen Ⅱ：F5′-GCCTGGT GTTCATGGGTTT-3′，R5′-GTCCCTTCTCACCAGGT TTG-3′。根據(jù)SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR，具體條件：95℃預(yù)變性2 min，然后95℃30 s，55℃30 s（記錄熒光信號(hào)），共40 個(gè)循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt進(jìn)行半定量計(jì)算[20-21]。

1.2.4 Western 印跡 分析采用正常軟骨作為對(duì)照組（A）；新生組織作為實(shí)驗(yàn)組（B）。對(duì)所獲取的軟骨組織，采用RIPA 裂解法提取總蛋白，并用BCA 法測(cè)定蛋白含量。之后取10 μg 蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10% SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜至0.45 μm 的PVDF 膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，與β-actin（1∶5 000）、collagenⅡ（1∶2 000）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK，1∶1 000）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK，1∶1 000）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK，1∶2 000）或磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK，1∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日與相應(yīng)的HRP 耦聯(lián)二抗（1∶3 000）孵育，之后利用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行成像分析，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析[22]。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)鏡評(píng)估 新生軟骨情況在接受首次關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)，根據(jù)ICRS 分級(jí)系統(tǒng)，10 例患者（10%）的脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)或股骨髁關(guān)節(jié)軟骨具有3 級(jí)病變，37例患者（74%）具有2 級(jí)病變，3 例患者（6%）具有1 級(jí)病變。在二次關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)，2 例患者（4%）為3級(jí)病變，26 例患者（52%）為2 級(jí)病變，22 例患者（44%）為1 級(jí)病變。依據(jù)再生評(píng)分，在二次關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)，有47 例患者（94%）能夠觀察到新生軟骨（2 級(jí)），僅有3 例患者（6%）未觀察到新生軟骨（1級(jí)）（圖1）。

圖1 關(guān)節(jié)鏡檢測(cè)Fig 1 Arthroscopic examination

2.2 病理學(xué)及分子生物學(xué)評(píng)估 新生軟骨組織HE和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明，新生組織周圍具有關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)合或覆蓋，并可見(jiàn)明顯的纖維化軟骨或軟骨陷窩（圖2A、2B）。番紅O 固綠染色結(jié)果顯示，新生組織內(nèi)可見(jiàn)呈紅色的軟骨組織及軟骨陷窩，亦可見(jiàn)呈綠色的骨組織（圖2D）。免疫組化結(jié)果顯示，Ⅱ型膠原呈陽(yáng)性表達(dá)（圖2C）。

圖2 HTO 術(shù)后新生組織的病理學(xué)染色分析Fig 2 Pathological staining of regenerated tissues after HTO surgery

2.3 新生組織與正常軟骨組織CollagenⅡmRNA 表達(dá)差異 采用qRT-PCR 檢測(cè)新生組織（b）與正常軟骨組織（a）內(nèi)CollagenⅡmRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖3A）：新生組織內(nèi)CollagenⅡ的相對(duì)表達(dá)量與正常軟骨組織間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.00，P＞0.05）。

圖3 再生組織與正常軟骨組織ERK 信號(hào)通路變化分析Fig 3 Changes of ERK signaling pathway in regenerated tissues and normal cartilage tissues

2.4 新生組織與正常軟骨組織CollagenⅡ和MEKERK 信號(hào)通路表達(dá)差異 Western 印跡結(jié)果顯示，新生組織（b）與對(duì)照組（a）CollagenⅡ表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.00，P＞0.05，圖3B、3C）。同時(shí)，新生組織（b）內(nèi)p-ERK 和p-MEK 蛋白呈高表達(dá)（圖3B），兩組間表達(dá)差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.8、15.44，均P＜0.05，圖3D）。

3 討論

軟骨退變是骨性膝關(guān)節(jié)炎的常見(jiàn)癥狀。根據(jù)軟骨的組織學(xué)特點(diǎn)，軟骨退變通常被認(rèn)為是不可逆過(guò)程。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，骨性膝關(guān)節(jié)炎患者的骨贅面軟骨能夠分泌Ⅱ型膠原，這些軟骨被稱作纖維化軟骨[17]。作為關(guān)節(jié)退化的代償性反應(yīng)，纖維化軟骨可以從關(guān)節(jié)軟骨遷移至外周骨，使得退化的軟骨表面得以穩(wěn)定和恢復(fù)，使一些骨性膝關(guān)節(jié)炎患者的癥狀逐漸減輕甚至消失[23]。在經(jīng)截骨術(shù)改善患者關(guān)節(jié)的負(fù)重力線后，關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變亦可以逐漸減緩或者消失[24]。這些現(xiàn)象說(shuō)明，退變軟骨具有自我修復(fù)的潛能。

關(guān)節(jié)軟骨所處的解剖學(xué)部位具有十分復(fù)雜的生理學(xué)和力學(xué)微環(huán)境，機(jī)械刺激對(duì)于維持關(guān)節(jié)軟骨正常的結(jié)構(gòu)和功能具有非常重要的意義[25]。Xu 等[26]通過(guò)給予大鼠終板軟骨細(xì)胞間歇周期性機(jī)械拉伸發(fā)現(xiàn)（0.5 Hz，10%強(qiáng)度，4 h/d，5 d/周），拉伸刺激促進(jìn)了終板軟骨細(xì)胞的增殖。Fukuda 等[27]給予終板軟骨細(xì)胞以不同強(qiáng)度的周期性拉伸，發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的拉伸能促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞增殖及糖胺多糖合成，然而高強(qiáng)度的拉伸則抑制了軟骨細(xì)胞增殖及糖胺多糖合成。由此可見(jiàn)，在適度的拉伸強(qiáng)度下，終板軟骨細(xì)胞的增殖以及合成代謝都得到了增強(qiáng)，有利于軟骨結(jié)構(gòu)和功能的維持。然而當(dāng)拉伸強(qiáng)度超過(guò)一定限度時(shí)，軟骨細(xì)胞的增殖則受到抑制，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整性和功能的破壞。在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室骨性關(guān)節(jié)炎患者中，內(nèi)側(cè)間室面的軟骨受到超負(fù)荷的機(jī)械拉伸刺激，引起軟骨損傷[26]。HTO 能夠降低下肢軸線異常引起的膝內(nèi)側(cè)間室的負(fù)荷，將其轉(zhuǎn)移至膝蓋外側(cè)，從而促進(jìn)膝內(nèi)側(cè)間室面軟骨再生，緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[28]。

本研究采用關(guān)節(jié)鏡發(fā)現(xiàn)，在膝內(nèi)側(cè)間室的軟骨損傷處具有新生組織生成。接著，通過(guò)HE 染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化確認(rèn)了這些新生組織為軟骨組織。在分子機(jī)制層面，發(fā)現(xiàn)HTO 術(shù)后內(nèi)側(cè)間室新生組織的Ⅱ型膠原含量與正常軟骨相比，沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步說(shuō)明HTO 有可能促進(jìn)缺損部位軟骨的修復(fù)與再生。另外，通過(guò)Western 印跡發(fā)現(xiàn)這些組織中高表達(dá)磷酸化形式的ERK。ERK分子屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，在多種細(xì)胞中均具有重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[11]。

ERK 被磷酸化之后進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[29]。Shakibaei 等[30]發(fā)現(xiàn)，姜黃素和白藜蘆醇可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中ERK 的活化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生存以及增殖，并且抑制了白細(xì)胞介素（IL）-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。相反，ERK 抑制劑則能夠抑制軟骨細(xì)胞增殖。目前尚不清楚ERK 信號(hào)是否參與調(diào)控接受關(guān)節(jié)鏡聯(lián)合HTO 的膝骨關(guān)節(jié)炎患者術(shù)后的軟骨再生。本研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者在術(shù)后1 年左右均出現(xiàn)損傷處的軟骨再生，新生組織呈Ⅱ型膠原和磷酸化ERK 高表達(dá)。綜上得出結(jié)論：在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室骨性關(guān)節(jié)炎患者中，關(guān)節(jié)鏡聯(lián)合HTO 能夠引起膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ERK 信號(hào)通路的活化和細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)軟骨再生。