敬雨潔，黃 嬌，張瑩丹，帥雨瑤，譚紫君

（樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000）

貝母屬（FritillariaL.）為百合科百合亞科百合族的重要類群，中國貝母屬植物共有24 種2 變種[1]，主要分布在西南部的青藏高原及橫斷山區(qū)，新疆地區(qū)，長江中下游地區(qū)及東北地區(qū)，其中14 種2 變種為我國特有種。分布于青藏高原及橫斷山區(qū)的貝母植物是川貝母及其近緣種，它們在分子系統(tǒng)樹上聚為了一支，共囊括了9種和1變種，被稱為“川貝母復(fù)合群”[2-3]。川貝母為我國重要的中藥資源，是道地藥材，其鱗莖具有鎮(zhèn)咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用。川貝母近緣種在外形上與川貝母常常混淆，尤其是川貝母與華西貝母，野外形態(tài)特征鑒定極為相似，要從形態(tài)特征上準(zhǔn)確識別川貝母與華西貝母常有一定困難。

在野外采樣中，我們在四川西嶺雪山和峨眉山分別采得了三種貝母，從形態(tài)學(xué)上鑒定為川貝母、華西貝母和峨眉貝母。為了準(zhǔn)確識別這三種貝母植物，我們分別測序了三種貝母的nrITS 序列，比較三者的核基因序列的差異，同時從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載了三種貝母所有的nrITS 序列，與采集所得貝母的nrITS 序列進(jìn)行綜合比較分析，在此基礎(chǔ)上，通過分子系統(tǒng)發(fā)育樹探討了三種貝母的系統(tǒng)位置和分類鑒定。目前尚未見對峨眉貝母的nrITS序列的研究報(bào)道，本研究旨在為川貝母及其近緣類群的分子分類鑒定提供相應(yīng)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

川貝母1 號、華西貝母1 號從西嶺雪山采集獲得，峨眉貝母1號、2號從峨眉山采集獲得，由樂山師范學(xué)院黃嬌副教授鑒定，所有采集的樣品都是來自經(jīng)硅膠快速干燥的新鮮葉子，其余的序列在GenBank 中下載（見表1）。

表1 貝母樣品來源

植物DNA 提取試劑盒、瓊脂粉、Gold View?、Marker DL 2000 plus、2×Taq Master Mix 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；ITS 序列擴(kuò)增引物購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。所用各種試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品總DNA提取

根據(jù)康為世紀(jì)植物DNA 提取試劑盒所述步驟進(jìn)行操作，提取樣品中的DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序

通過文獻(xiàn)查找，確定擴(kuò)增ITS 序列的引物為通用引物序列（見表2）。在PCR 管內(nèi)配置30 μL 的反應(yīng)體系，如表3 所示?；靹蚝?，用封口膜封口。PCR 儀循環(huán)程序設(shè)置94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸10 min，共計(jì)35個循環(huán)[3]。PCR 擴(kuò)增完成后，用1%的瓊脂糖凝膠對2 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的條帶，用Gene Genius &Gene Gnome 凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，將有條帶的PCR 產(chǎn)物片段送去成都生工生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

表2 ITS序列DNA條形碼引物

表3 PCR管內(nèi)反應(yīng)體系

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

獲得測序結(jié)果后，利用Seqman軟件進(jìn)行序列的拼接，把低質(zhì)量序列和引物部分去除，再將序列提交GenBank，申請序列登錄號。利用MEGA 6.0 軟件分析序列特征，結(jié)合GenBank 上下載的其余川貝母、華西貝母序列進(jìn)行分析對比，以及變異位點(diǎn)分析，并建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置bootstrap為1 000次重復(fù)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果

所有樣品均得到ITS 片段擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小約在750 bp，PCR產(chǎn)物用凝膠電泳檢測有單一清晰條帶，無拖尾現(xiàn)象（見圖1）。由于3、7 兩個川貝母樣品和4、6兩個華西貝母樣品，以及2、5兩個峨眉貝母2號樣品的ITS 序列堿基完全一致，故以下分別只對1 個序列結(jié)果進(jìn)行分析。

圖1 三種貝母PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果

2.2 三種貝母ITS堿基序列及片段的特征結(jié)果

經(jīng)過序列比對，峨眉貝母1 號與峨眉貝母2 號的ITS 序列堿基非完全匹配，前者的ITS 序列總長度為707 bp，后者為724 bp，18S rDNA 長度峨眉貝母1 號為46 bp，峨眉貝母2號為55 bp，ITS1、5.8S rDNA 和ITS2二者均為212 bp、161 bp和238 bp，28S rDNA長度峨眉貝母1 號為50 bp，峨眉貝母2 號為58 bp（見圖2）。川貝母的ITS 序列總長度為723 bp，18S rDNA 長度為55 bp，ITS1 長度為212 bp，5.8S rDNA 長度為161 bp，ITS2 的長度為237 bp，28S rDNA 長度為58 bp；華西貝母的ITS 序列總長度為715 bp，18S rDNA 長度為56 bp，ITS1 長度為212 bp，5.8S rDNA 長度為161 bp，ITS2 的長度為238 bp，28S rDNA 長度為48 bp。堿基序列詳見圖3、圖4。

圖2 峨眉貝母1號（左）和峨眉貝母2號（右）ITS堿基序列

圖3 西嶺雪山川貝母ITS堿基序列

圖4 西嶺雪山華西貝母ITS堿基序列

2.3 不同貝母樣品的ITS序列比較

將三種貝母的ITS 序列與GenBank 中下載的共21條ITS 序列進(jìn)行比較（見表4）。由表可知，所有序列總長度在612～730 bp，序列長度變化幅度不大。其中以華西貝母2 號、新疆貝母的序列長度最短。在核苷酸組成含量上，A 含量為17.7%～20.1%，T 含量為16.6%～18.2%，G 含量為32.8%～34.2%，C 含量為29.2%～31.1%，各種貝母樣品的A、T、G、C 含量差別不大，GC含量為62.4%～65.3%，遠(yuǎn)高于AT含量。

表4 不同貝母樣品的ITS序列比較

經(jīng)比對后，對5'端和3'端進(jìn)行裁剪，中間序列長度為630 bp，通過Mega6.0 軟件序列比對分析，21 條ITS 序列檢測到變異位點(diǎn)39 個，其中簡約信息位點(diǎn)14個，單一突變位點(diǎn)25 個，分別占變異位點(diǎn)總數(shù)的35.89%和64.11%。所有供試樣品的ITS1 為212 bp，含有變異位點(diǎn)19 個；5.8S 為161 bp，含有變異位點(diǎn)2個；ITS2 為237～238 bp，含有變異位點(diǎn)18 個。14 個簡約信息位點(diǎn)分別在第16、29、66、78、96、118、122、217、420、430、501、546、556、586 位點(diǎn)；單一突變位點(diǎn)分別在第5、9、63、90、91、97、98、120、121、127、195、204、224、417、418、426、451、458、465、559、564、572、588、594、620 位點(diǎn)（見表5）。

表5 不同貝母樣品的ITS 序列變異位點(diǎn)

2.4 不同貝母樣品ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖5 可知，不同貝母樣品主要分為兩大枝，其中川貝母1、2、3、5、7、8、10 號，華西貝母1、2、3 號聚為一簇（支持值為76），峨眉貝母1、2 號聚為一簇（支持值93），這兩簇和川貝母4、6、9、11、12、13、14 號聚為一大簇（支持值95），最后與新疆貝母、浙貝母聚為一簇，外類群郁金香和輪葉貝母在根部，說明由ITS 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹能將“川貝母復(fù)合群”與浙貝母、新疆貝母有效分離鑒定。在“川貝母復(fù)合群”中，本研究中樣本川貝母1 號（Fritillaria cirrhosa1）與華西貝母 1 號（Fritillaria sichuanica1）聚為1簇，表示二者親緣關(guān)系較近，較難區(qū)分；用ITS 序列能將峨眉貝母有效分離鑒定。

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的貝母NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

中國貝母屬植物大部分以鱗莖入藥，具有很高的藥用價值，是著名中藥材，盡管《中國藥典》對貝母藥材所使用的物種有明確規(guī)定，但是在民間同一地區(qū)的貝母在使用時并不區(qū)分，以川貝母為例，在青藏高原及其毗鄰的橫斷山脈地區(qū)，該區(qū)域內(nèi)的十余種貝母植物經(jīng)常是不加區(qū)分地進(jìn)行采集并使用，這對臨床用藥的有效性和安全性會造成很大的隱患。目前對于“川貝母復(fù)合群”的物種鑒別，形態(tài)學(xué)鑒定是最基本的鑒定方法，但此方法在對親緣關(guān)系較近、形態(tài)特征差異不明顯的不同種貝母植物中難以實(shí)現(xiàn)有效的鑒別[5-6]。

近年來隨著分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，核糖體ITS 片段常用于物種分類鑒定研究，因其進(jìn)化速率快，在植物屬間和種間有較多的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，對于用來探討植物的種內(nèi)、種間，以及近緣種間變異是有效的分子手段之一[7-8]。本研究對野外采集的三種貝母的ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測序，對其序列特征進(jìn)行分析，并結(jié)合GenBank 上下載的19條序列分析其原始序列特征及變異位點(diǎn)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，包含了目前GenBank 上釋放的所有川貝母和華西貝母ITS 樣本。結(jié)果表明，本研究中所采集的川貝母與GenBank 上釋放的川貝母的ITS 序列間存在較多的變異位點(diǎn)，而華西貝母與川貝母之間的變異位點(diǎn)較少。在NJ系統(tǒng)樹上表現(xiàn)為，川貝母并不聚為一支，華西貝母嵌套進(jìn)川貝母種間，造成此種現(xiàn)象的原因可能為：1）GenBank上釋放的部分川貝母和華西貝母鑒定有誤；2）華西貝母還未分化完全，物種形成尚在進(jìn)行之中，推測華西貝母與川貝母有非常近的親緣關(guān)系；3）川貝母種內(nèi)遺傳變異較大，其遺傳變異受到地理分布、種間雜交、基因漸滲等的影響[3,9]。本研究首次報(bào)道了峨眉貝母的ITS 序列，峨眉貝母兩個樣品間有1 個變異位點(diǎn)，可能是提取時操作誤差引發(fā)的錯誤堿基序列；通過NJ系統(tǒng)樹分析，峨眉貝母與川貝母及華西貝母能有效分離（支持值＞70），說明ITS 序列可以用于“川貝母復(fù)合群”中種間的鑒定，但是對于親緣關(guān)系較近、分化時間較短、快速進(jìn)化的種間還需要加入其他類型的DNA 條形碼或基因組學(xué)手段來共同探討。本文可為川貝母及其近緣種的種間鑒定研究提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。