程焰紅,魏霖,鐘國棟,李顏

腦膠質(zhì)瘤為一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,發(fā)病率占全身惡性腫瘤的1%～3%[1]。雖然手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療的綜合治療手段已經(jīng)取得長足進(jìn)步,但腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞較強(qiáng)的增殖和遷移能力的特點使此類患者治療效果不佳。因此,深入了解腦膠質(zhì)瘤增殖、遷移的分子機(jī)制有助于為腦膠質(zhì)瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。microRNA在內(nèi)的多種分子可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等諸多病理性行為中,多種microRNA可通過逆調(diào)控一些關(guān)鍵基因或者信號通路的表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[2]表明,在乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤組織中,miR-375均呈現(xiàn)出差異性的表達(dá);Jia等[3]研究發(fā)現(xiàn),miR-375在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平顯著降低且與患者的預(yù)后有關(guān),即miR-375的低表達(dá)可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。RWDD3是RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子,最初在垂體瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[4]。Ji等[5]研究表明,RWDD3在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平明顯升高,且與腫瘤惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)?？紤]到RWDD3在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用,并且miR-375及RWDD3在腦膠質(zhì)瘤中均呈現(xiàn)差異性表達(dá),因此,miR-375有可能是通過調(diào)控RWDD3的表達(dá)來對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用。鑒于此,本研究通過檢測miR-375靶向調(diào)控RWDD3對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,探究其在腦膠質(zhì)瘤中的潛在作用。

1 材料及方法

1.1 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意。49例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源于2017年12月—2022年8月我院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切除后組織病理學(xué)檢查證實為惡性膠質(zhì)瘤的患者,所有患者術(shù)前均未接受放化療及其他免疫治療。根據(jù)2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類修訂版的標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤組織進(jìn)行分級[6],其中Ⅰ級(毛細(xì)胞星型細(xì)胞瘤)9例、Ⅱ級(彌散性星型細(xì)胞瘤)15例、Ⅲ級(間變星型細(xì)胞瘤)13例、Ⅳ級(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)12例,Ⅰ、Ⅱ級為低惡性度組,Ⅲ、Ⅳ級為高惡性度組。正常腦組織取自腦外傷患者顱內(nèi)減壓術(shù)后切除的部分組織,共10例。標(biāo)本采集后立即置于凍存管中液氮保存。

1.2 細(xì)胞及試劑盒 U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫;miR-375 mimics及相應(yīng)陰性對照(NC)購買自中國廣州銳博生物科技公司,過表達(dá)質(zhì)粒pRWDD3及相應(yīng)陰性對照(pNC)購買自中國蘇州吉瑪基因股份有限公司;兔源抗GAPDH、RWDD3抗體(ab8245,ab28845)購于Abcam公司;總RNA提取試劑盒(R6834),購自O(shè)mega公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)購自美國Fermentas公司。

1.3 Western blot和RT-PCR法檢測腦膠質(zhì)瘤組織中RWDD3及miR-375的表達(dá) (1)Western blot:向正常對照組腦組織及膠質(zhì)瘤組織加入液氮后進(jìn)行研磨,加入適量的蛋白裂解液在冰浴條件下充分裂解30 min。收集至1.5 mL離心管中于4 ℃ 12 000 rpm離心15 min,吸取上清經(jīng)99 ℃變性10 min后放置于-20 ℃冰箱中備用。將10 μg的各樣品加入相應(yīng)的凝膠孔中,進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。5%脫脂牛奶封閉1 h后,加入一抗(GAPDH、RWDD3,1∶5 000), 4 ℃ 孵育過夜,TBST洗膜3次,后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)孵育2 h。TBST洗膜3次使用ECL液進(jìn)行顯影,并使用ImageJ軟件對薄膜帶上的蛋白進(jìn)行半定量分析。(2)RT-PCR:使用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的RNA,并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計miR-375、RWDD3相關(guān)基因的上下游引物(如表1所示),進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng),并使用ABI 7500 RT-PCR儀器檢測膠質(zhì)瘤組織中miR-375、RWDD3以及各組U251細(xì)胞中RWDD3 mRNA水平的表達(dá)情況,數(shù)據(jù)分析采用2-△△ct法進(jìn)行。見表1。

表1 引物序列

1.4 CCK8法及細(xì)胞劃痕實驗檢測miR-375、RWDD3對U251細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 (1)CCK8實驗:使用含10% FBS,1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃,5% CO2的條件下培養(yǎng)U251細(xì)胞,收集對數(shù)生長期細(xì)胞,PBS洗滌并重懸后以每孔1×104的密度接種于96孔板中。設(shè)立以下幾組實驗:對照組、轉(zhuǎn)染miR-375組、空載體組、RWDD3過表達(dá)組,每一組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至80%融合后分別根據(jù)分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)試劑,培養(yǎng)24 h后,向每孔加入10 L CCK-8溶液并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔下的吸光度(OD)值。(2)細(xì)胞劃痕:將U251細(xì)胞以1×106個/孔接種于12孔板中,根據(jù)上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48 h后用直尺比對,用10 μL的槍頭在每孔豎直劃1條直線,PBS緩沖液漂洗3次后換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并在顯微鏡下觀察拍照。24、48 h之后分別使用PBS緩沖液漂洗3次后,再次觀察拍照,使用Image J軟件測量劃痕的寬度并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 RT-PCR及Western blot法檢測轉(zhuǎn)染miR-375和對U251細(xì)胞中RWDD3表達(dá)的影響 RT-PCR:使用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的RNA,按1.3中RT-PCR的方法檢測各組RWDD3 mRNA的表達(dá)量;Western blot按1.3中使用總蛋白抽提試劑盒抽提各組細(xì)胞的蛋白,Western blot法檢測各組RWDD3蛋白的表達(dá)量。

1.6 CCK8及細(xì)胞劃痕實驗檢測過表達(dá)RWDD3后對 miR-375抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 實驗分為對照組、miR-375聯(lián)合空載體組以及miR-375和RWDD3共轉(zhuǎn)染組,其中對照組接受空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,miR-375聯(lián)合空載體組同時接受miR-375 mimics及空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染處理,miR-375和RWDD3共轉(zhuǎn)染組同時接受含有miR-375 mimics 及RWDD3基因的質(zhì)粒。CCK8法及細(xì)胞劃痕實驗操作同1.4。

2 結(jié)果

2.1 miR-375、RWDD3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR檢測49例不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織和10例正常腦組織miR-375和RWDD3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,miR-375表達(dá)情況:正常組織>低級別膠質(zhì)瘤組織>高級別膠質(zhì)瘤組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1A。RWDD3 mRNA表達(dá)情況:正常組織<低級別膠質(zhì)瘤組織<高級別膠質(zhì)瘤組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1B。

1A miR-375在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低1B RWDD3的mRNA在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高圖1 miR-375、RWDD3在低、高級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平

2.2 miR-375有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力 分別采用CCK8和細(xì)胞劃痕法檢測轉(zhuǎn)染miR-375膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖和遷移能力。與對照組比較,miR-375組的miR-375高表達(dá)后可以明顯抑制U251的增殖能力(圖2A)和遷移能力(圖2B)。

2A 轉(zhuǎn)染miR-375 mimics 后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的增殖能力降低2B 轉(zhuǎn)染miR-375 mimics 后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的遷移能力下降圖2 miR-375高表達(dá)對U251的增殖和遷移能力的影響

2.3 RWDD3促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖和遷移能力 同樣選擇CCK8和細(xì)胞劃痕法檢測轉(zhuǎn)染RWDD3質(zhì)粒后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖和遷移能力。結(jié)果顯示,與空載體組比較,RWDD3高表達(dá)可明顯促進(jìn)U251的增殖能力(圖3A)和遷移能力(圖3B)。

3A 轉(zhuǎn)染pRWDD3質(zhì)粒后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的增殖能力增加3B 轉(zhuǎn)染pRWDD3質(zhì)粒后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的遷移能力增加圖3 RWDD3表達(dá)升高對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的增殖和遷移能力的影響

2.4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-375后RWDD3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中轉(zhuǎn)染miR-375及空載體質(zhì)粒后,分別采用RT-PCR及Western blot檢測 RWDD3 mRNA和蛋白水平的表達(dá),結(jié)果顯示miR-375 可有效抑制 RWDD3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-375 mimics后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中RWDD3的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低

2.5 RWDD3恢復(fù)miR-375導(dǎo)致的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移能力 為觀察RWDD3是否可以恢復(fù)miR-375導(dǎo)致的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力,設(shè)置對照組、miR-375聯(lián)合空載體組及miR-375和RWDD3共轉(zhuǎn)染組。分別向3組細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒、miR-375+pNC及miR-375+pRWDD3,利用CCK-8細(xì)胞增殖實驗及細(xì)胞劃痕實驗觀察腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖能力,結(jié)果顯示,與對照組比較,miR-375和RWDD3共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖和遷移能力明顯下降(P<0.05);與miR-375聯(lián)合空載體組比較,miR-375和RWDD3共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖和遷移能力明顯上升(P<0.05)。見圖5。

5A RWDD3恢復(fù) miR-375抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力 5B RWDD3可恢復(fù) miR-375抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力圖5 RWDD3恢復(fù) miR-375抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,死亡率高,預(yù)后差,其中以高級別的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)最為嚴(yán)重。目前臨床上針對膠質(zhì)瘤的治療方法主要有放療、化療以及手術(shù)切除等,然而腫瘤細(xì)胞極強(qiáng)的增殖和遷移能力導(dǎo)致此類治療方法不佳,患者極易復(fù)發(fā)。miRNA表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致其調(diào)控的下游蛋白表達(dá)異常,直接參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。本研究選擇腦膠質(zhì)瘤中出現(xiàn)差異的miR-375及RWDD3作為研究對象,探討它們在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征以及對細(xì)胞功能的影響,旨在揭示腦膠質(zhì)瘤增殖、遷移的分子機(jī)制奠定前期研究基礎(chǔ)。

RWDD3是RWD 結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子,最初在垂體瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),且在小腦、心臟及腎臟等組織中均有所表達(dá)[7]。RWDD3可在缺氧、炎癥等多種外界刺激下表達(dá)升高,由于其具有強(qiáng)烈的促血管生成的能力,因此會參與諸多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。本課題在膠質(zhì)瘤組織中也發(fā)現(xiàn)RWDD3的表達(dá)升高,提示其同樣參與腫瘤的發(fā)生過程。TargetScan生物信息學(xué)軟件能分析潛在影響RWDD3的miRNA分子,結(jié)果顯示miR-375可靶向RWDD3的表達(dá)[8]。由于miRNAs是一類長度約20～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分RNA,其可以與下游靶基因mRNA的3’UTR區(qū)相結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致下游靶基因mRNA降解或抑制其翻譯過程,對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起著重要作用[9-10]。因此我們推測是由于正常腦組織、低級別及高級別膠質(zhì)瘤組織中miR-375的表達(dá)水平逐漸降低后,導(dǎo)致了膠質(zhì)瘤組織中RWDD3的表達(dá)升高。

miR-375位于人體細(xì)胞染色體長臂3區(qū)5帶上[11-12]。近年來有研究[13]表明,miR-375與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。為了進(jìn)一步證實miR-375對RWDD3調(diào)控作用,本研究在體外實驗中分析過表達(dá)miR-375對U251的增殖及遷移能力的影響,結(jié)果顯示,在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-375后,該細(xì)胞的增殖遷移能力降低,提示它是腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中重要的促進(jìn)因子。本研究結(jié)果與既往研究相符,miR-375 可通過下調(diào)JAK2/STAT3及MAP3K8/ERK 信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力[14],同時Tsukamoto等[15]發(fā)現(xiàn)miR-375在胃癌中表達(dá)量降低且其可通過PDK1和14-3-3zeta通路影響胃癌細(xì)胞的生存及凋亡能力。以上結(jié)果不僅提示miR-375可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,也預(yù)示著作為一種血液中可以檢測到的分子,同樣有希望作為一種監(jiān)控腦膠質(zhì)瘤病情進(jìn)展的分子,來早期預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及復(fù)發(fā)。

既往研究[8]發(fā)現(xiàn),RWDD3的表達(dá)在垂體瘤中升高,且敲減RWDD3的表達(dá)可抑制垂體瘤的侵襲能力。本研究通過實驗證實,轉(zhuǎn)染含有RWDD3的質(zhì)?？梢悦黠@促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,這表明RWDD3是一個腦膠質(zhì)瘤治療的促進(jìn)因子。TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-375可靶向RWDD3的表達(dá),且本研究細(xì)胞實驗中已經(jīng)證實過表達(dá)miR-375可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力,那么我們推測,在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中,是由于miR-375表達(dá)的降低導(dǎo)致了RWDD3表達(dá)升高,最終導(dǎo)致了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。

為證實該推論,本研究在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-375后檢測RWDD3含量的變化。Western blot及RT-PCR結(jié)果表明細(xì)胞中的RWDD3含量同樣降低,該結(jié)果說明miR-375可以直接作用于mRNA的3’UTR區(qū),發(fā)揮對RWDD3表達(dá)的抑制作用。為此,我們設(shè)計了回復(fù)實驗來驗證推測的可靠性,在U251細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-375及pRWDD3質(zhì)粒后,miR-375誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖遷移下降的能力明顯下降,證實RWDD3可有效恢復(fù)因miR-375抑制的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移能力。該結(jié)果進(jìn)一步表明miR-375在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下降,而miR-375水平下降會導(dǎo)致RWDD3水平升高,最終促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述,miR-375及RWDD3在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)差異性表達(dá),檢測血清中miR-375的含量可用于早期預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及復(fù)發(fā)。膠質(zhì)瘤中miR-375含量降低可以導(dǎo)致細(xì)胞中RWDD3的表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。